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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验31-40
作者:王泓 日期:2014-06-19
【临床意义】
临床医师可以根据涂片检查提供的信息决定是否开始早期的抗真菌治疗。对于实验室技术人员可以根据涂片检查提供的信息决定真菌培养所用的培养基。
【标本要求】
1.用于真菌感染检查目的的标本，如：组织、穿刺液、呼吸道标本、头发、皮肤刮片、甲、各种体液、分泌物等。
2.不可接受的标本 干的拭子、蜡盒、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。
3.标本处理
（1）组织标本应用研磨器彻底的研碎，否则KOH很难渗透到组织内部。
（2）体液（尿液、胸水、腹水、关节液）应用1500～2000g离心5分钟。
（3）甲碎屑应用研磨器研磨成粉状。
（4）脑脊液通常不用KOH处理，更建议进行隐球菌乳胶凝集试验或墨汁染色。
4.培养物 固体或液体培养基上生长的真菌。
【原理】
15% KOH甘油溶液可溶解标本，但由于真菌特殊的细胞壁结构而不被破坏。应能区别某些真菌的结构，如；有隔真菌丝、无隔真菌丝、芽生孢子、假菌丝、大的酵母样孢子（如皮炎芽生菌）、小球体（粗球孢子菌）、分生孢子梗（如曲霉）和硬壳小体（着色真菌）等。但应注意：涂片检查并不能替代真菌培养。
【仪器】
光学显微镜。
【试剂】
1.15% KOH甘油溶液，配制方法：
KOH 15g
甘油 20ml
无菌水 80ml
2.储存储存液25℃备用。
【操作步骤】
1.在玻片上编号，呼吸道标本、分泌物、便标本等使用无菌棉拭子涂片，清亮的体液标本使用甩片机甩片，浑浊或血性体液体标本使用无菌吸管将标本滴在玻片上涂匀。
2.紫外线照射30分钟。
3.滴加1～2滴15% KOH甘油溶液，将盖玻片盖上，静止一会儿再镜检观察（目的是让一定比重的物质沉淀于同一层面）。
4.制备好的玻片应在显微镜下细心的观察，注意观察某些特殊的真菌结构。
5.结果报告
（1）如镜检看到酵母样孢子及藕节样菌丝体报告：找到酵母样孢子及假菌丝。
（2）如镜检看到宽大（6～10μm）的分支不分隔、似飘带样的菌丝体报告：找到毛霉样真菌丝。
（3）如镜检看到透明，宽度介于念珠菌与毛霉菌之间的菌丝体，结构上分支分隔，且常是45°角分支。报告：找到有隔真菌丝，呈45°角分支，可疑曲霉。
（4）在任何标本中查到真菌丝（透明菌丝、着色菌丝、接合菌丝），或在任何无菌体液或组织中检出真菌，应电话通知患者的主管大夫。
（5）如看到酵母样或球形孢子，可能是皮炎芽生菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌时，应告知实验室上级主管并电话报告临床大夫。
6.注意事项
（1）每隔一周检查试剂。如果形成云雾状沉淀，重新制备。
（2）标本与使用的KOH比例适当，以适当溶解，并避免对标本过度稀释。
（3）每天在制备KOH压片时，制备一张空白对照，以确保试剂没有被其他微生物污染。
【参考文献】
Larone DH. Medically Important Fungi，A Guide to Identification. 4th ed. Washington D.C.: American Society for Microbiology Press，2002
【临床意义】
乳酸酚棉蓝是真菌镜检的标准浮载剂，棉蓝系酸性染料，能使真菌着色呈蓝色，且菌体越幼稚的部分着色越深。丝状真菌镜下形态，对菌种鉴定有非常重要的意义，鉴定结果可指导临床诊断和抗真菌治疗。
【标本要求】
已长成熟的丝状真菌。
【仪器和材料】
光学显微镜、玻片、透明胶带。
【试剂】
乳酸酚棉蓝（BBL，或自制）
配方：乳酸 20ml
苯酚晶体 20g（或苯酚液体20ml）
甘油 40ml
蒸馏水 20ml
棉蓝 0. 05g
方法：将上述体积的乳酸、苯酚和蒸馏水混合，如果使用苯酚晶体需加热，混合好后再加入棉蓝，混均即可使用，室温保存，有效期1年。
【操作步骤】
1.在一玻片上滴一滴乳酸酚棉蓝。
2.用剪刀剪一段约1cm长的透明胶带，将一边贴在棉拭子的木棒一端，形成旗帜样。
3.手持木棒，将胶带黏性一面按在菌落表面，将菌丝粘在胶带上。
4.在胶带粘有菌丝的一面，滴一滴酒精，将胶带粘有菌丝面向下，轻轻平放在滴有乳酸酚棉蓝的玻片上，取下木棒，胶带与乳酸酚棉蓝接触后尽量不要再移动，以免影响菌体形态观察。
5.在胶带上表面，滴加一滴乳酸酚棉蓝，盖上盖玻片后，置于镜下观察。
6.根据镜下结构，再结合培养基上菌落的生长时间、颜色、模样等等鉴定到属或种。
【注意事项】
1.制片一定要在生物安全柜中进行。
2.胶带一定要在玻片上拉平，如果起皱，影响观察效果。
3.制片时手法尽量放轻，一次成形，以免菌丝断裂及孢子脱落，影响镜下形态完整性。
4.需丢弃的玻片放入利器盒，高压灭菌。
【参考文献】
1.王端礼，李若瑜.医学真菌学实验室检验指南.北京：人民卫生出版社，2005
2. Larone DH. Medically Important Fungi，A Guide to Identification. 4th ed. Washington D C.:American Society for Microbiology Press，2002
【临床意义】
1.小培养对于观察菌落的自然生长和产孢状态，有非常重要的价值，有利于根据菌株镜下特点进行鉴定。
2.临床上常见的丝状真菌可以不用进行小培养，只有对少见真菌或需要观察特殊结构时，才需要进行小培养，以便进行鉴定。
【试剂和材料】
固体石蜡、铜圈、载玻片、盖玻片、酒精灯、镊子、无菌平皿、土豆培养基、纱布或棉花、刀片。
【操作步骤】
1.琼脂块法
（1）将刀片消毒，在土豆培养基上切一小块约1cm2面积的琼脂块，放在培养基表面。
（2）用接种针挑取待测菌株的菌丝，接种在琼脂块的四角上。
（3）将灭菌后的盖玻片放在琼脂块表面。
（4）每个平皿可以接种1～3个琼脂块，但一个平皿中只能培养一株病原菌。
（5）将平皿边缘用封口膜封口后，于28℃孵育，每天观察至产孢良好或菌丝丰富时，将盖玻片取下，制作乳酸酚棉蓝压片，在镜下观察。
2.铜圈法
（1）将铜圈、载玻片、盖玻高压灭菌备用。
（2）用小镊子夹铜圈在火焰上加热后，双面粘上少许石蜡，立即将其放在载玻片上，小孔朝上。
（3）在将盖片稍加热立即盖在铜圈上，形成一个密闭的小室。
（4）将融化的土豆培养基，用无菌注射器从铜圈小孔中注入，量为1／2。
（5）将载玻片横向放置待冷却凝固。
（6）将白金针消毒冷却后，挑取待测真菌，从铜圈小孔中贴盖玻片垂直刺入。
（7）将已接种好的小培养放入无菌平皿中，内放湿棉花或纱布。
（8）28℃孵箱培养，每2～3天用显微镜的高倍镜观察其生长情况，鉴定到属或种。
3.注意事项
（1）小培养和制片操作应在Ⅱ级生物安全柜中进行。
（2）小培养要经常观察其生长状态，以防菌落过度生长，难以观察。
（3）一个菌株的小培养，最好做多块琼脂块，以便多次观察菌株生长的不同阶段。
【参考文献】
1.王端礼，李若瑜.医学真菌学实验室检验指南.北京：人民卫生出版社，2005
2. Larone DH. Medically Important Fungi， A Guide to Identification 4th ed.Washington D. C.:American Society for Microbiology Press，2002
【方法与原理】
在与微量肉汤稀释（CLSI M37-A3）相似的条件下，在半固体培养基中，ATB FUNGUS 3试条测定念珠菌属和新型隐球菌对于抗真菌药物的敏感性。ATB FUNGUS 3试条包括16对杯状凹槽，第一对不含任何抗真菌药物，用作阳性生长对照。另外的15对包含不同稀释度的5种抗真菌药物（两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑），用于测定最小抑菌浓度（MIC）。
【仪器】
（35±2）℃培养箱，冰箱。
【试剂】
1.一套装包括（25份药敏测定）：
（1） 25个独立包装的ATB FUNGUS 3试条。
（2）25个孵育盖。
（3）25安瓿ATB F2培养基。
（4）25张结果记录单。
（5）1份说明书。
2.附加试剂及产品（不包括套装内）
（1）无菌生理盐水。
（2） McFarland标准比浊仪或2号McFarland标准比浊管。
（3）200μl可调微量移液器及吸头。
【操作步骤】
1.采集不超过4天的菌落，制备成2 McFarland的菌悬液（用McFarland标准比浊仪比浊，或是与2号McFarland标准比浊管比较）。
注意：保证接种物的纯度，如果培养物不纯必须分纯。
2.使用移液器取20μl菌悬液到ATB F2培养基的安瓿中，用吸管混匀。
3.使用移液器在每个杯状凹槽中加入135μl混匀的ATB F2培养基。
4.盖好试条盖子，置于湿盒。
5.在有氧条件下，35℃±2℃环境中，念珠菌属培养（24±2）小时，新型隐球菌培养（48±6）小时。
6.结果报告 把试条放在黑暗背景下进行肉眼判读。对每一个抗真菌药物从低浓度开始与生长对照比较，两性霉素B和氟胞嘧啶记录完全抑制生长的浓度为最低抗菌药物浓度（MIC），氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑与生长对照相比生长量有明显的减少（80%以上）的浓度可作为这些抗真菌药物的MIC。
【临床意义】
指导临床用药和真菌耐药监测。
【标本要求】
在沙保弱培养基（Sabouraud）上生长的24～48小时的纯菌落。
【原理】
Etest试条是预先制备的含梯度抗生素药物浓度的试条。贴在已接种细菌的平板后，经过一段时间温育，形成椭圆形抑菌环，椭圆形顶端边缘与试条相交处的抗菌药物浓度刻度即为抗生素的最低抑菌浓度（MIC）。
【仪器】
35℃孵箱，麦氏比浊仪或麦氏比浊管。
【试剂与材料】
1.试剂
（1） RPMI 1640培养基。
（2） Etest条（法国生物梅里埃公司）：氟康唑、氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B。
2.材料
（1） RPMI1640培养基（4mm±0.5mm厚）。
（2）灭菌生理盐水、灭菌吐温20。
（3）灭菌吸管、消毒棉拭子（不要缠的过紧）、剪刀和镊子、灭菌的螺旋盖试管（13mm×100mm）、0.5或1号标准麦氏比浊管、Etest贴条器、储存管等。
【操作步骤】
1.制备菌悬液
（1）念珠菌：生长于沙保弱培养基24小时的成熟菌落，用生理盐水制成0. 5McF浓度的菌悬液。
（2）新型隐球菌：生长48～72小时菌落，制成lMcF浓度的菌悬液。
（3）丝状真菌：生长于沙保弱培养基产孢良好的成熟菌落，用无菌生理盐水冲洗菌落表面（如果孢子难以冲洗下来，如曲霉，可在无菌生理盐水中加入少量无菌吐温20，不超过1%，以增大表面活性），制成一定浊度的孢子悬液（曲霉菌属0. 5McF；镰刀菌属和根霉菌属0.5～1McF）。
2.用无菌拭子沾菌液后挤干，轻轻在琼脂表面向三个方向均匀密涂，让水分至少在琼脂上吸收＜15分钟。
3.用贴条器或无菌镊子将Etest条贴在琼脂表面（贴前必须保证琼脂表面干燥，厚度均匀、平滑），注意一旦药条接触琼脂表面切勿移动。90mm培养基可贴2条，150mm培养基可贴5条。
4.培养念珠菌35℃孵育24～48小时，直至长出清晰的抑菌环；新型隐球菌35℃孵育48～72小时，直至长出清晰的抑菌环；丝状真菌35℃孵育48～72小时。
5.结果的判读 根据不同种药物的杀菌机制的不同，其判读方法各不相同。两性霉素B的终点判定在生长被完全抑制处；氟胞嘧啶的MIC值判定在95%的菌被抑制处；唑类药敏的MIC值判读在80%的菌被抑制处。
【临床意义】
阳性结果提示诺卡菌感染或分枝杆菌感染。
【标本要求】
1.痰液 取晨痰5～10ml，要深咳，可取2～3次。
2.支气管灌洗液 至少5ml，无菌容器送检。
3.尿液 取晨尿至少40ml送检。
4.脑脊液 2ml无菌容器送检。
5.关节液 2ml无菌容器送检。
6.胸、腹水、心包积液 尽可能多，血性标本要用聚茴香脑硫酸钠或肝素抗凝（切勿用EDTA抗凝，因为EDTA抑制分枝杆菌生长）。
7.血标本 5ml用聚茴香脑硫酸钠或肝素抗凝。
8.骨髓标本 0. 5ml用聚茴香脑硫酸钠或肝素抗凝。
【原理】
诺卡菌有部分抗酸性，不能被1%硫酸完全脱色。
【仪器】
普通光学显微镜。
【试剂】
1. 5%石碳酸复红溶液（carbol-fuchsin）
碱性复红酒精饱和液 10ml
5%石碳酸水溶液 90ml
混匀
2. 1%硫酸水溶液（aqueous solution of sulfuric acid）
硫酸 1ml
水 99ml
混匀
3.稀亚甲基蓝溶液（methylene blue）
亚甲基蓝 0. lg
95%酒精 50ml
0. 1%氢氧化钾 1ml
蒸馏水 1000ml
混匀
【操作步骤】
1.涂片，干燥。
2.石碳酸品红溶液染色5分钟（不需加温步骤）后，水洗。
3.加1%硫酸水溶液，脱色1分钟后，水洗。
4.加亚甲基蓝溶液染色30秒，水洗。
5.待干，油镜镜检。
【临床意义】
由诺卡菌属中某些种引起的疾病，可发生于任何年龄，好发于肺部和中枢神经系统，亦可血液播散于全身各器官。约49%的病例可发生在健康人，本菌有相当强的致病性。星形诺卡菌占90%，巴西诺卡菌占7%，豚鼠诺卡菌占3%。巴西诺卡菌致病力强，可引起暴发流行。星形诺卡菌可能为机会性致病菌。全身性诺卡菌病95%是经过空气传播的，为外源性感染。
【标本要求】
呼吸道标本、血、无菌液体、脓液、分泌物、CSF、痰、活检组织等。
【仪器】
35℃孵箱、显微镜。
【试剂】
不加氯霉素沙保弱平皿、血平皿。
【操作步骤】
1.直接涂片 先寻找颗粒、如有颗粒、压片镜检。
（1）革兰染色，油镜检查。诺卡菌有纤细菌丝，革兰染色阳性，染色不规则，呈串珠状。
（2）弱抗酸染色：部分或全部抗酸染色阳性。
2.标本 接种不加氯霉素的沙保弱平皿或血平皿→35℃孵育→48小时～7天→鉴定→报告结果。
3.7天未长报告诺卡菌培养阴性。
4.鉴定见表3-24。
表3-24 星形诺卡菌与巴西诺卡菌的鉴别
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星形诺卡菌
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巴西诺卡菌
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菌落
形态
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浅黄色、粉色、粉状
典型放线菌生长，G+b
菌丝体直、细小，球菌样、杆菌样、有泥土味
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白色、黄白色、粉状
角状分支，菌丝长G+b
短杆状，结节状、球菌样
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明胶液化
45℃
弱抗酸
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-
+
+
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+
-
+
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5.菌株保留纸片法保留，-80℃冻存。
6.注意事项
（1）阴性报告一定要放置7天，方可报告。
（2）注意与放线菌的区别，分枝杆菌的区别。
【参考文献】
王端礼.医学真菌学.北京：人民卫生出版社，472-475
【临床意义】
阳性结果提示分枝杆菌感染。
【标本要求】
1.尽量用药前采集标本。
2.痰液 患者清晨咳肺部痰于无菌防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中，最小标本量为3ml，最佳5～10ml。切勿唾液送检。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。送检频率为每天一次，连续三天。
3.支气管肺泡灌洗液，毛刷，经气管吸取物将灌洗液或吸取物置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中。最小标本量为3ml，最佳5～10ml。毛刷置于5ml无菌盐水中。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
4.尿液 患者留取晨尿于无菌无防腐剂的250ml尿液采集容器中或其他合适的容器中，最小量40ml。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。送检频率为每天一次，连续三天。
5.粪便 患者留取粪便5～10g（最少1g），直接放入无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中，不要使用运输培养基或防腐剂。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。不可用直肠拭子做分枝杆菌培养。
6.脑脊液 无菌采集2～3ml脑脊液（最佳为10ml）置于无菌且防渗漏的容器如50ml锥形管或其他合适的容器中。室温下尽快运送。勿冷藏和冷冻。
7.无菌体液（包括胸腹水、胆汁、关节液，穿刺液，心包积液，滑液等）无菌采集10ml或更多的体液标本置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中。不可用拭子采集体液。最小标本量为10～15 ml。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
8.脓肿（普通的或开放性的），蜂窝织炎，眼分泌物，组织对于普通脓肿，用无菌盐水或70%乙醇清洁皮肤表面再用注射器采集脓液。对于开放性的破损或脓肿，从破损或脓肿边缘下的区域抽取标本。组织标本以无菌操作采集。脓液标本装入一个无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中，组织标本则置于2～3ml无菌盐水中并装入一个无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中。不要用商业运输拭子和转运培养基来运输标本。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
9.胃液 在患者清晨未进食前采集标本。用25～50ml无菌蒸馏水进行灌洗。采集15ml标本置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，则在标本采集一小时内用100mg碳酸钠中和标本，然后室温尽快运送。送检频率为每天一次，连续三天。
10.涂片标本（如支气管毛刷涂片和骨髓涂片） 将涂片置于涂片盒中送检。
11.不可接受的标本 干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24小时后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。
【方法与原理】
萋尼染色法（冷染法）：分枝杆菌因其菌体的表面有一层类脂或脂质皮膜不易着色，但一经着色后，酸或乙醇的作用不容易把它脱色。所以经抗酸染色后分枝杆菌为粉红色，其他细菌和背景为淡蓝色。
【仪器】
涂片加热板，普通光学显微镜。
【试剂】
本实验室使用的是（台资）珠海贝索（BASO）生物技术有限公司生产的萋尼染色液。脱色液用完后，可自制3%盐酸酒精溶液作为脱色液。
1.5%石碳酸复红溶液（carbol-fuchsin）
碱性复红酒精饱和液 10ml
5%石碳酸水溶液 90ml
混匀
2.3%盐酸酒精溶液（acid alcohol）
浓盐酸 3ml
95%酒精 97ml
混匀
3.稀亚甲基蓝溶液（methylene blue）
亚甲基蓝 0. lg
95%酒精 50ml
0.1%氢氧化钾 1ml
蒸馏水 1000ml
混匀
【操作步骤】
1.标本处理
（1）痰标本：将痰标本置于50ml离心管，在生物安全柜中加入一定量的消化液（若标本无需培养，则加2～3倍量的BASO溶痰剂；如标本还需要进行培养，则用梅里埃公司的痰标本去污染处理液进行消化处理），充分混匀作用15～20分钟后，3000转／分钟离心15分钟，取沉淀涂片。
（2）胸腹水、脑脊液等无菌体液，如标本体积＞1ml，则将标本置于50ml离心管中3000转／分钟离心15分钟后，取沉渣涂片；如标本体积＜1ml，用甩片机甩片，2000转／分钟甩片5分钟。
（3）尿标本：将静置的尿标本小心倾倒上层，将最底部的40～50ml尿标本倒入50ml离心管，3000转／分钟离心15分钟，取沉渣涂片。
（4）组织：加少量无菌肉汤，于无菌研磨器中研磨后，涂片；如标本量较大，使用燃烧灭菌后的剪刀，将标本剪碎后再研磨。
（5）涂片后，如有剩余标本，2～8℃保存3天后，高压灭菌处理。
2.涂片除甩片外的标本，用无菌棉拭子或吸管挑取标本，在载玻片上涂成20mm×20mm的标本膜，置于生物安全柜内的加热板上80℃干燥固定，紫外线照射至少1小时。
3.染色
（1）石碳酸复红溶液染色7～8分钟（不需加温步骤）后，流水轻轻冲洗。
（2）加3%盐酸酒精溶液脱色1～2分钟至近无色，流水轻轻冲洗。
（3）加亚甲基蓝溶液染色30秒，流水轻轻冲洗，待干，镜检。
（4）每次染色，同时做阴、阳性质控片。阳性质控片为已知抗酸染色阳性痰标本高压灭菌后涂片，阴性质控片为大肠埃希菌ATCC25922菌液涂片。质控染色结果记录于《萋尼染色质控记录表》。质控片染色结果正确，方可进行临床标本阅片。
4.光学显微镜油镜观察物镜100×，目镜10×，观察300个视野或整个标本区。抗酸菌正常形态为细长微弯曲，两端钝圆的杆菌，镜下可见集聚成团状，常呈分枝状排列，无芽胞、荚膜及鞭毛。抗酸菌为粉红色。其他细菌及细胞呈为蓝色。除菌型为杆状菌外，在染色标本上也可见到细长丝状、串珠状、球形及颗粒等。其发育分为五个阶段：滤过型、颗粒、球菌、短杆菌及成熟杆菌。
5.结果报告萋尼染色镜检阴性，直接向临床报告“萋尼法抗酸染色阴性”。萋尼染色阳性，向临床报告“萋尼法抗酸染色阳性”（表3-25）。然后立即电话报告给临床和院感办并登记《危急报告记录表》。所有分枝杆菌涂片检查均需在收到标本后24～48小时内发出报告。
6.涂片假阳性结果的原因和修正措施
（1）使用的玻片被其他标本污染：使用新的未被污染的玻片进行涂片。
表3-25 萋尼染色法的镜检结果报告方式
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萋尼染色法
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报告方式
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（油镜，1000倍）
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0
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抗酸染色阴性
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1～2条/300视野
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+／-（重检或制作新涂片，报告实际所见菌数）
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1～9条/100视野
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1+
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1～9条/10视野
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2+
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1～9条／视野
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3+
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＞9条／视野
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4+
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注：发出涂片报告时，应注意注明使用的染色法及所观察到涂片的抗酸菌数，只需观察足以计算出涂片平均菌数的视野即可，计算菌数时一团菌体或一双菌体都是以一个菌体计算，因为都只能在培养基上长出一个菌落，有成团菌体时应注明，因为会影响真正菌体计算
（2）抗酸杆菌在制片和染色过程中从阳性涂片移至阴性涂片：制片和染色过程中避免玻片彼此接触，勿使用夹片夹；使用镊子等夹取标本片子时，不要触及标本。
（3）食物颗粒：要求临床再送标本。
（4）染色剂中的沉渣：需使用新鲜配制的染色剂，无沉淀。
（5）抗酸杆菌通过物镜上的镜油在涂片中相互污染：每次看完涂片后都擦拭物镜上的镜油。
7.涂片假阴性结果的原因和修正措施
（1）涂片太厚导致在染色过程中被冲掉：对标本进行消化处理并避免涂片过厚。
（2）涂片区域太大导致涂片过薄：涂片区域大约在2cm2即可。
（3）染色效果不好：把涂片在紫外线下照射，然后进行热固定；染色剂需保存在黑色瓶中；在染色过程中，每步骤间的冲洗水需尽量除去以免将下一个染色剂稀释。
（4）涂片显微镜下观察不够：观察够足量的视野。
8.阳性涂片的保存 萋尼染色阳性的涂片置于保本盒中保存一年以备日后查用。
9.分枝杆菌检查结果季度总结 每个季度末对当季度的涂片和培养结果进行统计分析，分析内容包括：
（1）阳性涂片在当月所有涂片中的比率。
（2）涂片阳性患者的连续涂片结果分析。
（3）涂片阳性，培养阴性的标本分析。
（4）涂片阴性，培养阳性的标本分析。
【临床意义】
阳性结果提示分枝杆菌感染。
【标本要求】
1.尽量用药前采集标本。
2.痰液 患者清晨咳肺部痰于无菌防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中，最小标本量为3ml，最佳5～10ml。切勿唾液送检。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。送检频率为每天一次，连续三天。
3.支气管肺泡灌洗液，毛刷，经气管吸取物 将灌洗液或吸取物置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中。最小标本量为3ml，最佳5～10ml。毛刷置于5ml无菌盐水中。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
4.尿液 患者留取晨尿于无菌无防腐剂的250ml尿液采集容器中或其他合适的容器中，最小量40ml。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。送检频率为每天一次，连续三天。
5.粪便 患者留取粪便5～10g（最少1g），直接放入无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中，不要使用运输培养基或防腐剂。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。不可用直肠拭子做分枝杆菌培养。
6.脑脊液 无菌采集2～3ml脑脊液（最佳为10ml）置于无菌且防渗漏的容器如50ml锥形管或其他合适的容器中。室温下尽快运送。勿冷藏和冷冻。
7.无菌体液（包括胸腹水、胆汁、关节液、穿刺液、心包积液、滑液等）：无菌采集10ml或更多的体液标本置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中。不可用拭子采集体液。最小标本量为10～15ml。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
8.脓肿（普通的或开放性的），蜂窝织炎，眼分泌物，组织 对于普通脓肿，用无菌盐水或70%乙醇清洁皮肤表面再用注射器采集脓液。对于开放性的破损或脓肿，从破损或脓肿边缘下的区域抽取标本。组织标本以无菌操作采集。脓液标本装入一个无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中，组织标本则置于2～3ml无菌盐水中并装入一个无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中。不要用商业运输拭子和转运培养基来运输标本。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
9.胃液 在患者清晨未进食前采集标本。用25～50ml无菌蒸馏水进行灌洗。采集15ml标本置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他合适的容器中。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，则在标本采集一小时内用100mg碳酸钠中和标本，然后室温尽快运送。送检频率为每天一次，连续三天。
10.涂片标本（如支气管毛刷涂片和骨髓涂片） 将涂片置于涂片盒中送检。
11.不可接受的标本 干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24小时后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。
【方法与原理】
1.方法金胺（O）染色法。
2.原理分枝杆菌经金胺（O）染液染色后，在含有紫外光源的荧光显微镜下发出橘黄颜色，高倍镜（物镜40×，目镜10×）下，抗酸杆菌产生黄绿色荧光，呈杆状或分枝状。
【仪器】
涂片加热板，荧光显微镜。
【试剂】
本实验室使用的是（台资）珠海贝索（BASO）生物技术有限公司生产的金胺（O）荧光染色液。2、3液用完后可按下述配方自制。
1液：金胺（O）染液。
2液：0.5%盐酸酒精：取浓盐酸0. 5ml加70%酒精100ml，混匀。
3液：0.5%高锰酸钾：取高锰酸钾0.5g加蒸馏水100ml混匀。
Sputumlysis（溶痰剂）：珠海贝索（BASO）生物技术有限公司生产。
【操作步骤】
1.标本处理
（1）痰标本：将痰标本置于50ml离心管，在生物安全柜中加入一定量的消化液（若标本无需培养，则加2～3倍量的BASO溶痰剂；如标本还需要进行培养，则用梅里埃公司的痰标本去污染处理液进行消化处理），充分混匀作用15～20分钟后，3000转／分钟离心15分钟，取沉淀涂片。
（2）胸腹水、脑脊液等无菌体液，如标本体积＞1ml，则将标本置于50ml离心管中3000转／分钟离心15分钟后，取沉渣涂片；如标本体积＜1ml，用甩片机甩片，2000转／分钟甩片5分钟。
（3）尿标本：将静置的尿标本小心倾倒上层，将最底部的40～50ml尿标本倒入50ml离心管，3000转／分钟离心15分钟，取沉渣涂片。
（4）组织；加少量无菌肉汤，于无菌研磨器中研磨后，涂片；如标本量较大，使用燃烧灭菌后的剪刀，将标本剪碎后再研磨。
（5）涂片后，如有剩余标本，2～8℃保存3天后高压灭菌处理。
2.涂片 除甩片外的标本，用无菌棉拭子或吸管挑取标本，在载玻片上涂成20mm× 20mm的标本膜，置于生物安全柜内的加热板上80℃干燥固定，紫外线照射至少1小时。
3.染色
（1）加金胺（O）染液，染15分钟，流水轻轻冲洗。
（2）加0.5%盐酸酒精脱色l～2分钟至近无色，流水轻轻冲洗。
（3）加0.5%高锰酸钾3分钟，流水轻轻冲洗，待干，24小时内荧光镜检（防止荧光淬灭）。
（4）每次染色，加做阴、阳性质控片。阳性质控片为已知抗酸染色阳性痰标本高压灭菌后涂片，阴性质控片为大肠埃希菌ATCC25922菌液涂片。质控染色结果记录于《金胺染色质控记录表》。质控片染色结果正确，方可进行临床标本阅片。
（5）标本经荧光染色后应及时观察，以免放置时间延长荧光强度下降。
4.荧光显微镜检查 蓝紫光滤片，物镜40×，目镜10×，观察100个视野。背景为黑色，抗酸菌呈黄绿色或黄橙色。菌体微弯，稍细，可见集聚成团状，常呈分枝状排列，无芽胞、荚膜及鞭毛。除菌型为杆状菌外，在染色标本上也可见到细长丝状、串珠状、球形及颗粒等。其发育分为五个阶段：滤过型、颗粒、球菌、短杆菌及成熟杆菌。此方法背景组织碎片的荧光大部分可被消除，视野清晰，但如复染过度可使抗酸菌荧光减弱。
5.金胺（O）染色镜检阴性，直接向临床报告“荧光法抗酸染色阴性”。
6.金胺（O）染色镜检阳性，若菌体形态典型则可直接向临床报告“荧光法抗酸染色阳性”。若菌体形态不典型则需进行萋尼染色确证。如仍有剩余标本，用标本再次涂片后进行萋尼染色；若标本无剩余，则将金胺（O）染色阳性涂片直接进行萋尼染色。萋尼染色使用油镜观察300个视野或整个标本区。萋尼染色阳性，向临床报告“荧光法抗酸染色阳性、萋尼法抗酸染色阳性”（表3-26）。然后立即电话报告给临床和院感办并登记《危急报告记录表》。萋尼染色阴性则向临床报告“萋尼法抗酸染色阴性”。荧光染色阳性涂片和萋尼染色阳性涂片保存1年。所有分枝杆菌涂片检查均需在收到标本后24～48小时内发出报告。
7.荧光显微镜高压汞灯寿命为200小时，发光强度减弱时应及时更换新灯泡。使用中避免反复开关，必须待灯泡冷却后再重新启动。
8.涂片假阳性结果的原因和修正措施
（1）使用的玻片被其他标本污染：使用新的未被污染的玻片进行涂片。
（2）抗酸杆菌在制片和染色过程中从阳性涂片移至阴性涂片：制片和染色过程中避免玻片彼此接触，勿使用夹片夹；使用镊子等夹取标本片子时，不要触及标本。
表3-26 萋尼染色法和荧光染色法的镜检结果报告方式
|
萋尼染色法
|
荧光染色法
|
报告方式
|
|
（油镜，1000倍）
|
（高倍镜，450倍）
|
|
|
0
|
0
|
抗酸染色阴性
|
|
1～2条/300视野
|
1～2条/70视野
|
+／-（重检或制作新涂片，报告实际所见菌数）
|
|
1～9条/100视野
|
2～18条/50视野
|
1+
|
|
1～9条/10视野
|
4～36条/10视野
|
2+
|
|
1～9条／视野
|
4～36条／视野
|
3+
|
|
＞9条／视野
|
＞36条／视野
|
4+
|
注：发出涂片报告时，应注意注明使用的染色法及所观察到涂片的抗酸菌数，只需观察足以计算出涂片平均菌数的视野即可，计算菌数时一团菌体或一双菌体都是以一个菌体计算，因为都只能在培养基上长出一个菌落，有成团菌体时应注明，因为会影响真正菌体计算
（3）食物颗粒：要求临床再送标本。
（4）染色剂中的沉渣：需使用新鲜配制的染色剂，无沉淀。
（5）抗酸杆菌通过物镜上的镜油在涂片中相互污染：每次看完涂片后都擦拭物镜上的镜油。
9.涂片假阴性结果的原因和修正措施
（1）涂片太厚导致在染色过程中被冲掉：对标本进行消化处理并避免涂片过厚。
（2）涂片区域太大导致涂片过薄：涂片区域大约在2cm2即可。
（3）染色效果不好：把涂片在紫外线下照射，然后进行热固定；染色剂需保存在黑色瓶中；冲洗涂片的水不可含过高浓度的氯，否则影响荧光染色效果；在染色过程中，每步骤间的冲洗水需尽量除去以免将下一个染色剂稀释。
（4）涂片显微镜下观察不够：观察够足量的视野。
10.分枝杆菌检查结果季度总结每个季度末对当季度的涂片和培养结果进行统计分析，分析内容包括：
（1）阳性涂片在当月所有涂片中的比率。
（2）涂片阳性患者的连续涂片结果分析。
（3）涂片阳性，培养阴性的标本分析。
（4）涂片阴性，培养阳性的标本分析。
【临床意义】
结核分枝杆菌的毒性物质主要为索状因子和硫脂，前者可作用于巨噬细胞的线粒体，影响细胞呼吸和氧化磷酸化作用，后者能阻止溶酶体吞噬体的融合，使细菌得以在巨噬细胞内长期生存和繁殖，菌体成分与其代谢产物引起免疫反应（Ⅳ型），导致一系列组织学变化。人体感染后可发生全身性疾病，常见有肺结核、结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、结核性腹膜炎、肾结核、肠结核及关节结核等。
非典型分枝杆菌在自然界分布广，对人的致病性较低，常可自健康人标本中分离到这类细菌。当局部或全身抵抗力降低时，可引起疾病。如Ⅰ群的堪萨斯分枝杆菌可引起肺部及皮肤、尿路、关节、腱鞘和淋巴结的感染；海分枝杆菌引起“游泳池肉芽肿”病及渔业工人创伤皮肤感染；猿分枝杆菌可使动物管理人员肺部感染。Ⅱ群的瘰疬分枝杆菌可侵犯儿童淋巴结引起病变；蟾分枝杆菌可致肺部感染；Szulgai分枝杆菌也可能引起肺部感染及腱鞘炎。Ⅲ群的胞内分枝杆菌能使鸡鸽致病外，可引起人支气管淋巴结炎或肺部感染（多见于AIDS病患者）；溃疡分枝杆菌可引起慢性顽固性皮肤溃疡病，尤其多发于四肢。Ⅳ群的偶发分枝杆菌偶尔致受伤皮肤脓肿；龟分枝杆菌通常不致病，有时可致肺部和淋巴结疾病，龟分枝杆菌脓肿亚种亦可引起皮肤感染。
【标本要求】
1.尽量用药前采集标本。
2.痰液 患者清晨咳肺部痰于无菌防渗漏的50ml锥形管或其他适当的容器中，最小标本量为3ml，最佳5～10ml。切勿唾液送检。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。送检频率为每天一次，连续三天。
3.支气管肺泡灌洗液，毛刷，经气管吸取物 将灌洗液或吸取物置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他适当的容器中。最小标本量为3ml，最佳5～10ml。毛刷置于5ml无菌盐水中。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
4.尿液 患者留取晨尿于无菌无防腐剂的250ml尿液采集容器或其他适当的容器中，最小量40ml。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。送检频率为每天一次，连续3天。
5.粪便 患者留取粪便5～10g（最少1g），直接放入无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他适当的容器中，不要使用运输培养基或防腐剂。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。不可用直肠拭子做分枝杆菌培养。
6.脑脊液 无菌采集2～3ml脑脊液（最佳为10ml）置于无菌且防渗漏的容器如50ml锥形管或其他适当的容器中。室温下尽快运送。勿冷藏和冷冻。
7.无菌体液（包括胸腹水、胆汁、关节液、穿刺液、心包积液、滑液等） 无菌采集10ml或更多的体液标本置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他适当的容器中。不可用拭子采集体液。最小标本量为10～15ml。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
8.脓肿（普通的或开放性的），蜂窝织炎，眼分泌物，组织对于普通脓肿，用无菌盐水或70%乙醇清洁皮肤表面，再用注射器采集脓液。对于开放性的破损或脓肿，从破损或脓肿边缘下的区域抽取标本。组织标本以无菌操作采集。脓液标本装入一个无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他适当的容器中，组织标本则置于2～3ml无菌盐水中并装入一个无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他适当的容器中。不要用商业运输拭子和转运培养基来运输标本。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，将标本冷藏。
9.胃液 在患者清晨未进食前采集标本。用25～50ml无菌蒸馏水进行灌洗。采集15ml标本置于无菌且防渗漏的50ml锥形管或其他适当的容器中。室温下尽快运送。如果运输时间超过一个小时，则在标本采集一小时内用100mg碳酸钠中和标本，然后室温尽快运送。送检频率为每天一次，连续三天。
【仪器】
35℃孵箱，离心机。
【试剂】
1.痰标本处理液（法国生物梅里埃公司，包括试剂1、2、3、4）。
2.改良罗氏（Lewenstein-Jensen）培养基（法国生物梅里埃公司）。
【操作步骤】
1.痰标本的接种程序取患者晨痰（非无菌标本）或支气管灌洗液5～10ml于灭菌的50ml螺口离心管中，加等量的试剂1+2混合溶液消化和去污染（试剂1为左旋半胱氨酸盐，试剂2为苯甲烷铵氯化物缓冲液，50mg试剂1溶解于10ml试剂2中，混匀后试剂必须立即使用）。用振荡器振荡30～60秒，混合均匀。置室温放15～30分钟后，加等量试剂3（pH6.8磷酸缓冲液），混匀。以3000转／分钟离心20分钟。小心将上清液倒入含消毒剂（与上清液混合后最终有效氯浓度至少达2000mg/L）的防溅废液瓶内，沉淀加1ml试剂4（0.2%牛血清生理盐水），混匀后取0. 5～1ml注入改良罗氏（Lewenstein-Jensen）培养基。化验单和罗氏管上均需注明化验号和接种日期。
2.尿液标本的接种 尿液若体积＞50ml则先静置过夜，弃去上清，取最下部液体40～50ml倒入50ml离心管中。若尿液体积＜50ml，则直接倒入50ml离心管中。3000转／分钟离心15分钟，弃上清，混匀沉渣后取0. 5～1ml直接注入改良罗氏（Lewenstein-Jensen）培养基。化验单和罗氏管上均需注明化验号和接种日期。
3.无菌部位标本的接种 无菌部位标本主要包括无菌体液和组织标本。组织标本需用研磨器仔细研磨后再接种罗氏培养基。无菌体液则3000转／分钟离心15分钟后弃上清，混匀沉渣后取0.5～1ml直接注入改良罗氏（Lewen-stein-Jensen）培养基。化验单和罗氏管上均需注明化验号和接种日期。
以上操作除离心外均在生物安全柜中进行，在生物安全柜外不可开启装有标本的离心管。改良罗氏培养基接种标本后应拧上盖，标注好标本号和日期，再从生物安全柜中取出。
4.标本的孵育改良罗氏培养基接种标本后要及时放入35℃孵箱，先将盖子稍微拧松并斜面向上斜置培养，2天后观察斜面、拧紧盖子并将管子直立放置培养。接种后，前2周每周观察2次（周一和周四），以后每周观察1次（周四）。应仔细观察观察斜面上有无分枝杆菌菌落生长以及有无细菌生长等，记录菌落形态、数量、色泽变化和出现时间等，并记录观察日期和观察结果。若有黄色干燥菌落生长，取出培养基在生物安全柜中涂片，经紫外线照射至少1小时后做萋尼染色。萋尼染色阳性结果随时报告。
分枝杆菌培养基上菌落特点：黄色或乳白色干燥颗粒状，不透明，表面呈皱纹状，形似菜花。
5.分枝杆菌普通培养报告程序35℃培养8周后，罗氏培养基上无菌生长或有菌生长，但经萋尼染色确认不是抗酸杆菌者，报告为“分枝杆菌培养阴性”，报告单上注明培养温度和培养时间。对于结核培养8周后阴性的标本，如果它的结核涂片是阳性，则应该再继续培养4周，若4周后仍为阴性才发出培养阴性报告。
35℃培养过程中，罗氏培养基上，一旦发现有菌生长，立即进行萋尼染色，如果萋尼染色阳性则报告为“分枝杆菌培养阳性”（报告单需注明的内容如下所示），然后立即电话报告给临床和院感办并登记《危急报告记录表》；如果萋尼染色阴性则应继续放置8周，期间若检出分枝杆菌则随时报告。
分枝杆菌罗氏培养阳性报告需包括以下内容：
（1）菌株培养的温度：孵育出可见菌落所采用的温度。
（2）菌株培养的时间：标本接种至长出可见菌落所需的时间。
（3）初次分离菌落的数量：报告菌落数量可参考表3-27。
轰3-27 分枝杆菌罗氏培养报告方式
|
观察结果
|
报告方式
|
|
无可见菌落
小于50个菌落
50～100个菌落
100～200个菌落
200～500个菌落（经常会融合在一起）
大于500个菌落（融合在一起）
|
分枝杆菌培养阴性
实际菌落数
1+
2+
3+
4+
|
6.污染的处理
（1）污染率：分枝杆菌培养中的污染可来源于标本、污染的试剂或环境。一般而言，对于罗氏培养基可接受的污染率为2%～5%，液体培养基可接受的污染率相对高一些。
（2）对污染进行监控的措施：用5ml无菌蒸馏水作为阴性质控标本，伴随每一批标本进行相同的处理程序。阴性质控必须在整个孵育过程中为阴性结果，如果阴性质控培养出抗酸杆菌，则同批处理的所有标本的培养结果均为无效，需要对整个培养程序进行分析找到污染来源。假如阴性质控中检出细菌，则同批处理的培养阳性结果仍有效，但需进行以下整改措施：
a）分析处理标本的所有步骤。
b）确保所有试剂的无菌性。
c）对生物安全柜进行消毒。
d）在生物安全柜中添加营养补充剂或抗生素。不能同时打开多个标本管，标本管开盖后不能长时间敞口。对多个标本管添加同一种试剂时需换用吸管。
e）接种标本时一次只打开一个标本管，接种完毕后立即盖上盖子。
（3）交叉污染
以下情况提示可能有交叉污染：
a）某段时间内培养阳性率高出实验室常规的培养阳性率。
b）涂片阴性的标本培养阳性，并且在该标本的同批次处理标本中有涂片阳性的标本。
c）患者的症状体征极不支持分枝杆菌感染，并且与该患者标本同批次处理标本中有培养阳性的标本。
（4）以下措施可以减低交叉污染的几率：
a）配制新鲜的试剂。
b）对试剂进行小量分装。
c）在标本处理过程中不要使标本挨得太近。
d）处理标本时一次只开一个标本管，加完试剂后立即盖上盖子。
e）在标本中添加试剂时不要使吸管与标本管壁接触。
f）加试剂时防止液体溅出。
g）处理过程中如果手套被标本污染需更换手套。
h）对标本进行混匀或震荡处理后，需等5分钟左右才可开启标本管。
7.常见分枝杆菌的菌型鉴别见表3-28。
表3-28 常见分枝杆菌鉴别
|
类
型
|
分群
|
菌型
|
生长温度℃
|
产生色素
|
菌落形状
|
生长速度
|
耐热
触
|
硝酸
还原
|
吐温80
水解
|
尿素酶
试验
|
|||
|
28
|
37
|
45
|
光
|
暗
|
|||||||||
|
缓慢生长菌
|
结核
菌群
|
人型结核菌
|
-
|
+
|
-
|
-
|
-
|
R
|
2～8周
|
-
|
+
|
-
|
+
|
|
牛型结核菌
|
-
|
+
|
-
|
-
|
-
|
R（S）
|
2～8周
|
-
|
-
|
-
|
+
|
||
|
RunyonⅠ
|
堪萨斯分枝杆菌
海分枝杆菌
猿分枝杆菌
|
+
+
+
|
+
-/+
+
|
-
-
-
|
黄
黄
黄
|
-
-
-
|
R（S）
S（R）
S
|
1～3周
2～4周
2～3周
|
+
-/+
+
|
+
-
-
|
+
+
-
|
+
+
+
|
|
|
RunyonⅡ
|
累分枝杆菌
M.Szulgai
戈氏分枝杆菌
|
+
+
+
|
+
+
+
|
-
-
-
|
橙
橙
橙
|
橙
橙
橙
|
S
S
S
|
2～3周
2～3周
2～3周
|
+
+
+
|
-
+
-
|
-
-/+
+
|
+
+
-/+
|
|
|
RunyonⅢ
|
蟾分枝杆菌
鸟分枝杆菌
胞内分枝杆菌
胃分枝杆菌
无色分枝杆菌
溃疡分枝杆菌
|
—
+
+
+
+
+
|
+
+
+
+
+
-
|
+
+
-/+
-
-
-
|
黄（-）
-
-
-
-
-
|
黄（-）
-
-
-
-
-
|
S
S
S
S
S（R）
S
|
3～4周
2～3周
2～3周
2～4周
2～4周
4～7周
|
+
+
+
-
+
+
|
-
-
-
-
+
-
|
-
-
-
+
+
-
|
-
-
-
+
-
-
|
|
|
迅
速
生
长
菌
|
RunyonⅣ
|
偶发分枝杆菌
龟分枝杆菌龟亚种
龟分枝脓肿亚种
转黄分枝杆菌
草分枝杆菌
耻垢分枝杆菌
牡牛分枝杆菌
|
+
+
+
+
+
+
+
|
+
+
+
+
+
+
+
|
-
-
-
-
+
+
-
|
-
-
-
黄
黄
-
黄
|
-
-
-
黄
黄
-
淡黄
|
R
R
R
R（S）
R（S）
R
R
|
＜3天
＜3天
＜3天
＜7天
＜3天
＜3天
＜3天
|
+
+
+
+
+
+
+
|
+
-
-
+
+
+
+
|
-/+
-
-
+
+
+
+
|
+
+
+
+
+
+
+
|
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