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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验41-50
作者:王泓 日期:2014-06-19
【临床意义】
同“分枝杆菌罗氏培养”。
【标本要求】
同“分枝杆菌罗氏培养”。
【仪器】
1.BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养监测系统。
2.MB BacTTM 240全自动分枝杆菌培养监测系统。
3.BACTEC9120、FX细菌／分枝杆菌培养监测系统。
4.离心机。
5. 35℃孵箱。
【试剂】
1.BACTEC MGIT 960系统试剂
（1） 2%N-乙酰-L半胱氨酸-NaOH标本前处理液：用50ml 4%NaOH溶液和50ml 2.9%枸橼酸钠溶液配制100ml混合液，加入0.5g N-乙酰-L半胱氨酸（NALC），混匀。在24小时内使用。
（2）无菌PBS（pH6.8）。
（3）BBL MGITTM7ml Tube（7ml培养管）。
（4）7H9肉汤。
（5）BACTECTMMGITTM960 Growth Supplement（生长添加剂）：为15ml液体试剂，可直接使用；于2～8℃冰箱保存，避免冷冻或过热。生长添加剂打开后应尽快用完，尽量避光保存。
（6）BACTECTMMMGITTM960 PANTA（杂菌抑制剂）：为冻干试剂，以15mlBACTECTMMGITTM960 Growth Supplement（生长添加剂）溶解并颠倒混匀后使用；溶解后于2～8℃冰箱保存，可保存5天。
2.BACTEC9120、FX系统试剂。
【操作步骤】
1.标本处理
（1）可适用的标本种类：痰液、胃液、胸腹水、脑脊液、组织和粪便。
（2）标本消化方式：采用碱消化方式，选用2%NALC-NaOH（NALC+2%NaOH）消化液。NALC可溶解黏液且温和去污染，使分枝杆菌从黏液中游离，偶可将NaOH浓度提高到3%，以控制污染。NALC于24～48小时内使用。
（3）痰液标本前处理
a）挑取约5ml（不超过10ml）痰液至50ml已标记的离心试管中。
b）加等量的2% NALC-NaOH前处理液（不超过10ml），强力旋涡振荡20秒。如果痰液很黏稠，可多加入一些前处理液，并重复震荡。
c）室温静置15～20分钟；请勿超过20分钟（以防杀死结核菌）。
d）加无菌PBS（pH6.8）至约50ml，盖紧盖子。
e）离心3000g，15分钟；倒掉上清液。
f）添加1～3ml PBS（pH6.8）以中和pH至6.8。
g）处理后标本可接种至MGIT培养管进行液体培养，同时可接种罗氏培养基进行固体培养，亦可进行涂片染色。
（4）胃液标本前处理
a）挑取约＜10ml胃液至50ml已标记的离心试管中，如标本量＞10ml，则标本须离心后，在沉淀液加5ml无菌生理盐水，标本含黏液时可添加NALC液化。
b）加等量的2% NALC-NaOH前处理液；强力旋涡振荡20秒。
c）室温静置15～20分钟；请勿超过20分钟。
d）加无菌PBS（pH6.8）至约50ml，盖紧盖子。
e）离心3000g，15分钟；倒掉上清液。
f）添加1～3ml PBS（pH6.8）以中和pH至6.8。
g）取0. 5ml接种至MGIT培养管，同时可接种固体培养基，及涂片染色。
（5）其他体液标本（包括脑脊液、胸水、腹水等）前处理
a）若体液为无菌的，可直接接种至MGIT培养管内。
b）若检体量＞10ml，离心3000g，15分钟，取沉淀液接种。
c）若检体受其他菌污染时，须经去污染处理。
d）取0. 5ml接种至MGIT培养管，同时可接种固体培养基，及涂片染色。
（6）组织标本前处理
a）加1g NALC至组织上溶解组织。
b）加5ml 7H9肉汤，以剪刀或研磨器将组织均匀碾碎。
c）挑取约5ml碾磨液至50ml已标记的离心试管内。
d）加等量的2%NALC-NaOH前处理液；强力旋涡振荡20秒。
e）室温静置15～20分钟；请勿超过20分钟。
f）加无菌PBS（pH6.8）至约50ml，盖紧盖子。
g）离心3000g，15分钟；倒掉上清液。
h）添加1～3ml PBS（pH6.8）以中和pH至6.8。
i）取0. 5ml接种至MGIT培养管，同时可接种固体培养基，及涂片染色。
（7）粪便标本前处理
a）挑取约1g粪便至50ml已标记的离心试管内，加5ml 7H9肉汤，混合均匀。
b）加等量的2% NALC-NaOH前处理液；强力旋涡振荡20秒。
c）室温静置15～20分钟；请勿超过20分钟。
d）加无菌PBS（pH6.8）至约50ml，盖紧盖子。
e）离心3000g，15分钟；倒掉上清液。
f）添加1～3ml PBS（pH6.8）以中和pH至6.8。
g）取0. 5ml接种至MGIT培养管，同时可接种固体培养基，及涂片染色。
2.标本接种
（1）血标本接种：由抽血人员进行床旁接种，1～5ml血液注入BACTECTMMYCO/F-Lytic培养瓶，培养周期42天。培养瓶送达实验室后，实验室人员需在检验申请单上注明培养瓶的编号和接种日期，并且对标本编实验号，将标签贴于检验申请单和培养瓶上。培养瓶上也要注明接种日期。将培养瓶放入BACTEC 9120或FX全自动培养仪进行分枝杆菌培养。
（2）其他标本接种
a）在MGIT 7ml培养管中先加入0.8ml用Growth Supplement（生长添加剂）溶解后的PANTA（杂菌抑制剂）。
b）接种0. 5ml处理后的标本至BBL MGIT培养管中。
c）接种完成后的培养管上机检测。
3.培养阳性报警后，进行萋尼染色并接种罗氏培养基 萋尼染色阳性，向患者所在病房及院感办报告“分枝杆菌培养阳性”；萋尼染色未见细菌，必须在5小时内重新放入仪器，或罗氏培养8周；萋尼染色阴性，但可见细菌应对标本重新进行去污染处理再次培养，或罗氏培养8周。
4.培养阴性后，报告“分枝杆菌培养阴性”。
【临床意义】
分枝杆菌感染一直是全世界重要的社会经济问题和医学问题。
在1995年，死于分枝杆菌感染的人数多于任何其他感染性疾病。根据CDC的报告，分枝杆菌感染的发生率将由1995年的750万升至2005年的1190万人。该病的死亡率估计在未治疗的患者中为55%，在接受治疗的患者中为15%。
常规的分枝杆菌感染诊断性试验如痰抗酸杆菌检测、痰或其他体液的培养、皮肤结核菌素试验以及放射性显像检查都不能获得很好的诊断敏感率。
事实上，用于临床和流行病学分枝杆菌诊断的最好方法是血清学试验如血凝试验、补体接合试验、免疫荧光法、ELISA和放射免疫扩散技术等。但在非发达国家用上述方法进行分枝杆菌检测时，高度专业的技术人员和昂贵的试剂常常阻碍了它们的推广。
分枝杆菌快速诊断试验是一个快速的定性筛查试验，可以检测出血清、血浆或全血内抗Koch杆菌的抗体。该试验能特异地检测出疾病活动期患者体内的抗体。预防接种患者的标本不能与该试剂盒起反应。
【标本要求】
血清，血浆（肝素锂盐或铵盐，EDTA），或全血。
注意事项：
1.样本应在标准的实验室条件下无菌采集，以免发生溶血。
2.全血样本应立即检测。
3.样本如在采集后48小时内检测，应储存于4～8℃冰箱。
4.样本如在采集48小时后检测，应予以冷冻。冷冻、样本在检测前应完全融化，充分混匀，并于检测前平衡至室温。应避免样本的反复冻融。
5.如果血清浑浊、黏度高，或有微粒性物质进入样本，检测前应用等体积（V/V）的稀释液（没有提供，如要求则可提供）进行稀释。
【方法与原理】
该方法使用了一对特殊的组合试剂：抗人免疫球蛋白抗体与染料的接合物十高度纯化的BCG蛋白，可以特异地检测出KOCH抗体。这种方法主要检测IgG和IgA，但IgM在浓度较高时也能检测到。
该项试验的灵敏度为350个单位，而以往的研究中认为该值是评价分枝杆菌血清学检测系统特异度、灵敏度和预示值的最好Cut-off界值。当样本流过吸液板时，抗人免疫球蛋白抗体与染料的接合物与人IgG抗体结合形成抗原抗体复合物。这种复合物在阳性反应区与BCG蛋白结合产生玫瑰红色带。加入样品中没有BCG抗体，在阳性反应区内不会形成粉色带。反应混合物继续流过吸液板中的反应区和控制区。未与样本结合的物质会与控制区内的试剂结合，产生玫瑰红色带，证明所使用的试剂是合格可靠的。
【试剂】
每个试剂盒可用于进行20次试验。
1.TB反应板，20个。
2.含有缓冲盐、去污剂和叠氮盐（NaN3＜0. 1%）的稀释液，5ml。
3.塑料吸管20根。
4.说明书，1份。
【操作步骤】
1.检测前，样本与TB快速检测试剂盒应平衡至室温。
2.沿裂口撕开包装，取出反应试剂盒。
3.在试剂盒上标记患者姓名和化验号。
4.用吸管吸取样本（血浆或血清），垂直滴加1滴（25μl）于样本孔（ω）中，如使用全血，应在样本孔（ω）中滴加2滴（50μl）。
5.在样本孔（ω）中滴加3～4滴（150μl）稀释液。
6. 15分钟后才可解释结果
（1）阴性：质控窗（C）中只显示一条质控色带。
（2）阳性：检测窗（T）中除质控条带，还出现另一明显条带。
（3）不能确定：如果检测窗（T）和质控窗（C）中都没有明显条带，则不能判断检测结果，应重复测定。
7.方法局限性
（1）尽管本实验较准确，医生也应根据其他临床信息来评价实验结果。
（2）结核菌感染极早期，由于在患者血清、血浆或全血标本中抗TB抗体的浓度较低，可能会有假阴性结果。
（3）TB快速检测实验表现为与其他分枝杆菌有高的交叉反应，应予以鉴别。
（4）阳性结果不能排除是由于其他致病菌所致。
（5）由于结核病的免疫抑制反应，疾病进展期患者的标本可以表现为阴性结果（体液中抗体浓度较低）。
【临床意义】
1.阳性 如果筛选试验阳性，应报告阳性，并将标本稀释做抗原滴度试验。可做墨汁染色镜下找隐球菌。
2.阴性 一个患者的一份标本乳胶试验阴性并不能完全排除隐球菌感染的可能。尤其是患者的临床症状被考虑为隐球菌病时，需做近一步检查和墨汁染色镜下找隐球菌。
【标本要求】
1.脑脊液标本2ml，送检前室温（25～30℃）放置，不可冷藏。
2.全血标本2ml（不加抗凝剂），密闭容器存放及时送检（2小时内），如不能及时处理则2～8℃冷藏。
【方法与原理】
1.方法 乳胶凝集试验。
2.原理 抗隐球菌荚膜多糖抗原抗体致敏乳胶微粒，与待检血清或脑脊液混合后，如果标本中存在荚膜多糖，即发生肉眼可见的乳胶凝集反应。灵敏度：3.2ng/ml。
【仪器】
56℃水浴箱、100℃水浴箱、离心机。
【试剂】
美国Immuno-Mycologics公司产品。
1.GBDA（10ml）甘氨酸白蛋白缓冲稀释液10×，pH8.6，使用前用无菌蒸馏水1: 10稀释。
2.ACLR（3.5ml）用兔抗隐球菌球蛋白致敏的标准大小的乳胶微粒。使用前充分混匀，切勿冻存。
3.DE（1. 75ml）裂解酶，使用前用1.75ml的无菌蒸馏水溶解，立即分装，每支50μl，-20℃冻存（35×50μl），解冻后立即使用，否则DE会自身分解。
4.AGC（2ml）含羊抗兔球蛋白和模拟的类风湿因子，用于验证DE。
5.NC（1ml）阴性对照，为标准羊血清，第一次使用时，56℃灭活30分钟。
6.酶抑制剂（6ml） 用于抑制DE。
7.LCAC（1ml） 质控品，低水平隐球菌抗原质控，含15 ng／ml新型隐球菌荚膜多糖抗原。
除DE溶解后必须在-20℃冻存外，其余试剂于2～8℃保存。试剂尽量避免长期在室温存放。
【操作步骤】
1.血清标本操作
（1）对于每一份被检标本，取出冷冻的50μl DE管一支。
（2）吸取300μl血清标本，加入含DE的试管中。
（3）充分混匀，密闭管口，置56℃水浴30分钟。
（4）取出试管加入1滴酶抑制剂，混匀。
（5）用加样器吸取25μl的LCAC，NC和DE处理后的待测标本分别置于玻片圆圈内。
（6）摇匀抗隐球菌乳胶试剂，加25μl于每个圈内。
（7）充分混匀圈内容物，摇动反应5分钟，在暗背景亮光处观察结果。
（8）结果判读：在5分钟内有白色颗粒状凝集为乳胶凝集试验阳性（分4级+）。否则报告乳胶凝集试验阴性。
2.脑脊液标本操作
（1）对于每一份被检标本，取≥100μl标本放入Eppendorf管中1000g×15min离心。
（2）弃去沉淀取上清，置100℃水浴5分钟
（3）用加样器吸取25μl的LCAC，NC和DE处理后的待测标本分别置于玻片圆圈内。
（4）摇匀抗隐球菌乳胶试剂，加25μl于每个圈内。
（5）充分混匀圈内容物，摇动反应5分钟，在暗背景亮光处观察结果。
（6）结果判读：在5分钟内有白色颗粒状凝集为乳胶凝集试验阳性（分4级+）。否则报告乳胶凝集试验阴性。
3.每月DE质控操作 测定用DE处理前后的抗球蛋白的质控。经DE处理的AGC和未经DE处理的AGC均进行与上述标本相同的操作步骤（1～8步），同时设立LCAC和NC对照。每月的DE质控中，未经DE处理的必须高于2+，经过DE处理的必须＜1+。质控不合格意味着蛋白水解酶活性不稳定，应使用新的DE试剂。
4.抗原滴度试验 若标本反应为1+或以上，则需做抗原滴度试验。
（1）在96微孔板一排孔（孔1→孔10）中每孔加入50μl标本稀释液。
（2）在第一孔中加入50μl处理过的患者标本，混匀。
（3）从第一孔中取出50μl加入第二孔，混匀后再从第二孔取出50μl加入第三孔，照此步骤一直加到第10孔，标本是最终稀释度为1：2→1: 1024。
（4）加25μl隐球菌抗原阳性质控、阴性质控和各个稀释度的标本于反应圈内。
（5）再加25μl隐球菌乳胶于反应圈内，并混匀。
（6）室温下手摇或混匀器100转／分钟，5分钟。
（7）读结果，确定标本中的抗原滴度。
【临床意义】
机体感染伤寒、副伤寒后体内会产生一定量的抗体。一般当H≥1：160、O≥1: 80，A、B≥1: 80时才有诊断意义。病程中应每周复查一次，如患者H与O的凝集价均高于参考范围或抗原凝集价4倍以上升高，则患伤寒的可能性大。若H的凝集价高而O在正常范围内，则可能是以往预防接种疫苗或非特异性回忆反应所致。
【标本要求】
普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
【方法与原理】
1.方法特异性凝集反应，是伤寒、副伤寒的辅助诊断方法。
2.原理伤寒、副伤寒菌液与待测血清发生抗原抗体反应，根据凝集效价判定待测血清中伤寒或副伤寒抗体的滴度。
【仪器】
1. 37℃恒温水箱。
2.微量振荡器。
【试剂】
兰州生物制品研究所产品。伤寒O（菌体O抗原）、H（鞭毛H抗原）和副伤寒A、B菌液抗原（70亿菌／ml），使用时用生理盐水（NS）1：5稀释为工作浓度。
【操作步骤】
1.待检血清先用NS 1：10稀释，再在V型板中进一步稀释。每份血清选择4行V形孔，每行7孔，各孔分别加入25μl生理盐水，在每行第1孔加入25μl1：10稀释的待检血清，然后对各行进行倍比稀释至第5孔，即1: 20、1: 40、1：80、1：160、1：320，每行第6孔作阴性对照，第7孔加入阳性对照。第1～4行分别加入25μl工作浓度的H、O、A、B菌液抗原，最终血清稀释度为1: 40、1：80、1：160、1：320、1：640。在振荡器上混匀，反应板加盖，37℃水浴过夜，次日观察结果。本实验为微滴法，应注意吸量准确，倍比稀释过程中避免气泡并充分混匀。
2.结果判读
（1）阳性：V形孔底出现梅花形凝集。凝集反应结果判断为：（++++）、（+++）、（++）、（+）、（±）和（-），以呈现（++）的血清最高稀释度为终点效价。
（2）阴性：菌液沉于V形孔底部，且集中于一点，与阴性对照孔相同。
【参考范围】
抗体阴性或抗体滴度H＜1：160，O＜1: 80，A、B＜1：80。
【临床意义】
机体感染立克次体后，产生相应抗体。用与立克次体有共同菌体抗原的变形杆菌OX19、OX2、OXK进行非特异性凝集反应，检测患者血清中有无立克次体抗体。该抗体在发病后5～12天出现，持续数月后逐渐消失。凝集效价在1：160或以上，双份血清抗体4倍或以上升高有诊断意义。我国常见的立克次体病主要为流行性斑疹伤寒和恙虫病，流行性斑疹伤寒主要表现为OX19凝集价升高，恙虫病主要表现为OXK凝集价升高。
【标本要求】
普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
【方法与原理】
非特异性凝集反应，是流行性斑疹伤寒的辅助诊断方法。变形杆菌OX19、OX2、OXK与立克次体具有共同菌体抗原，当与待检血清混合后发生交叉抗原抗体凝集反应，提示血清标本中抗体的存在。
【仪器】
37℃恒温水箱、微量振荡器。
【试剂】
兰州生物制品研究所产品。变形杆菌OX19菌液抗原（70亿菌／ml），使用时用生理盐水（NS）1：5稀释为工作浓度。
【操作步骤】
1.待检血清先用NS 1：10稀释，再在V形板中进一步稀释。每份血清选择1行V形孔，每行7孔，每孔加入25μl生理盐水，第1孔加入25μl的1: 10稀释的待检血清标本，倍比稀释至第5孔，即1: 20、1: 40、1: 80、1：160、1: 320，第6孔为阴性对照，第7孔为阳性对照。每孔加入变形杆菌OX19菌液抗原25μl，最终血清稀释度为1: 40、1: 80、1：160、1：320、1: 640。在振荡器混匀，反应板加盖，37℃水浴过夜，次日观察结果。本实验为微滴法，应注意吸量准确，倍比稀释过程中避免气泡并充分混匀。
2.结果判读
（1）阳性：V形孔底出现梅花形凝集。凝集反应结果判断为：（++++）、（+++）、（++）、（+）、（±）和（-），以呈现（++）的血清最高稀释度为终点效价。
（2）阴性：菌液沉于V形孔底部，且集中于一点，与阴性对照孔相同。
【参考范围】
阴性或滴度＜1：160。
【临床意义】
布氏杆菌病为人畜共患的传染病，常见菌型为牛、羊、猪三型，可引起母畜传染性流产。人与病畜接触或食用病畜及其乳制品，也可引起感染，我国以羊布氏菌最多见。人感染布氏杆菌后2周血清中出现特异性抗体，3～5周时效价最高。本试验比Wright血清学更敏感，且能够在疾病早期检测到抗体，如呈阳性反应，且凝集效价较高，结合临床可确诊。
【标本要求】
普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
【方法与原理】
1.方法直接凝集试验。
2.原理经孟加拉玫红（Rose Bengal）染色的布氏杆菌与待检血清混合后，如果血清存在布氏杆菌抗体，则发生肉眼可见的凝集反应。
【仪器】
混旋器。
【试剂】
法国生物梅里埃（bioMerieux）公司产品。
1.试剂R1 热和酚红灭活的布氏杆菌（牛流产布氏杆菌99型），经孟加拉玫红（Rose Bengal）染色，置于酸性缓冲液中（乳酸盐，pH3. 65）的杆菌悬液。
2.试剂R2 阳性对照血清（牛血清）。
3.材料 一次性凝集卡和搅拌棒。
【操作步骤】
将试剂和血清置于室温15分钟。取30μl血清和30μl试剂R1于反应卡孔内，用搅拌棒混匀。阳性对照：取30μl试剂R2和30μl试剂R1于另一反应卡孔内，搅拌混匀。缓慢摇动反应卡4分钟，观察凝集反应。不凝集为布氏杆菌抗体阴性，凝集（包括弱凝集）为阳性。
【参考范围】
布氏杆菌抗体阴性。
【临床意义】
降钙素原检测主要用于怀疑全身性细菌感染患者的早期诊断；鉴别诊断细菌感染还是非细菌感染引起的不明原因发热；脓毒症患者抗生素使用后的疗效观察及病情监测；帮助决定是否使用抗生素治疗，或停止使用抗生素治疗等方面。
【标本要求】
血清或血浆2ml。
采集血样标本后24小时内如不进行检测，样品必须-20℃条件下储存。样品可反复冻融3次。
【方法与原理】
B·R·A·H·M·S PCT LIA是一种免疫化学发光检测试剂，用于人血清或血浆中PCT浓度的定量分析。两种抗原特异性的单克隆抗体与PCT（抗原）的两个不同的结合位点（降钙素和降钙蛋白）结合，一种抗体是经化学发光标记（示踪剂），另一种固定在管腔内壁（包被管系统）。
孵育期间，两种抗体与样本中的PCT反应形成“夹心复合体”，结果化学发光标记的抗体被结合到管腔内壁，一旦反应结束，多余的示踪剂即可被清除。
用化学发光计与B·R·A·H·M·S Basiskit LIA试剂，通过残留在管壁上示踪剂发出的光对其进行定量分析。样本中化学发光强度直接与PCT浓度成正比。因此，用标准液建立标准曲线后，患者血清或血浆样本中的未知PCT浓度可通过标准曲线计算后读取数值。
另一种方法是用校正液代替标准液，样本中PCT浓度可通过与BRAHMSAktiengesellschaft制作的基本曲线比较后读取。
【仪器】
PCT-LIA LB 9507检测仪（德国B·R·A·H·M·S公司）。
【试剂】
1.PCT-LIA试剂盒（每盒可检测100份样本）
（1）试剂组成
a）试剂A:2×50管，包被检测管，用抗-PCT抗体包被（鼠单克隆抗体），直接使用。
b）试剂B:1瓶，冻干，示踪剂，抗-PCT抗体荧光标记，蓝色溶液。
c）试剂C:1瓶，29ml，缓冲液，用于示踪剂B的重组，可直接使用。
d）试剂G:1瓶，4ml，冻干，调零血清（人血清），用于重建标准，校正和对照，可直接使用。
e）试剂W:2瓶，每瓶11ml，冲洗液，以蒸馏水稀释至550ml。
f）试剂S1、S2/K1、S3、S4/K2、S5、S6:共6瓶，冻干，PCT标准液，使用前用0. 25ml调零血清制成。浓度范围：0.08ng／ml，0.3～0.7ng／ml，1.5～2.5ng/ml，16～24ng／ml，160～240ng/ml，400～600ng／ml，准确浓度详见试剂盒说明书。标准液S2/K1和S4/K2用于标准曲线的校正。
g）试剂KO1、KO2:2瓶，冻干，PCT标准液1、2，使用前用0.25ml调零血清制成，浓度见说明书。
（2）稳定性和储存条件
a）所有试剂使用前均以2～8℃原包装储存，可保存至各试剂瓶上所标明的使用期限。
b）稀释冲洗液2～8℃储存条件下可使用4周，一旦污染即不可再用，当液体中有絮状物或pH＜6时亦不可使用。
c）以调零血清溶解后的标准、对照和质控储存在-20℃条件下，可反复冻融10次。
d）配制好的示踪剂在2～8℃条件下可储存3天，或储存在-20℃条件下，可反复冻融10次。
2.PCR-LIA Basiskit试剂盒（每盒可检测1000份样本）
（1）试剂组成
a） BR1：3×105ml／瓶，0.1mol／L HNO3中含0.5%H2O2，打开即可使用。
b） BR2：3×105ml/瓶。0.25mol/L NaOH，打开即可使用。
c） BK1：2瓶，冻干，溶解于2ml蒸馏水（去离子水更好）。
d） BK2：2瓶，冻干，溶解于2ml蒸馏水（去离子水更好）。
（2）稳定性和储存条件
a） BR1、BR2：2～27℃储存，直至试剂瓶上所标明的使用期限。
b） BK1、BK2：2～8℃储存，直至试剂瓶上所标明的使用期限；复溶后的BK1、BK2可在2～8℃储存14天，或在-20℃冻存，避免反复冻融。
【操作步骤】
1.准备
（1）将试剂盒内容物及样本平衡至室温。
（2）溶解冻干粉组成示踪剂，标准和对照液。
（3）轻轻摇动所有液体试剂，包括样本血清（避免产生泡沫）。
（4）标记包被管。
（5）准备冲洗液：用蒸馏水将11ml冲洗液稀释到550ml。
（6）准备化学发光计，使用前冲洗管路。
2.由低到高吸取不同浓度的标准PCT标准液S1、S2、S3、S4、S5、S6（或S2/C1、S4/C2作基础曲线）20μl到包被试管。
分别吸取20μl的对照液K1、K2加到包被试管。
吸取20μl样本到标记好的包被试管。
注意：①每个样本更换一个新的微量吸头。
②在系列分析中，不要改变样本摆放的位置。
3.分别吸取250μl示踪剂至所有的测试管。
注意：许多B·R·A·H·M·S PCT LIA研究结果表明，吸取样本和试剂的时间过长可能引起数值的改变。建议在15分钟内完成步骤2、3以将影响减少到最小。在批内测定中，当工作时间超过15分钟后，单一个体的数值变化超过20%。
4.样品放置在混匀器上混匀，确保液相均匀。用黏性箔遮或封口膜盖管口，将样品放置在水平旋转仪（170～300转／分钟）上18～25℃孵育60～75分钟。
注意：孵育时避光，不能将试管直接暴露于光线中！
5.孵育结束后，在每个试管中加入1ml冲洗液，加冲洗液时要确保管壁的上部完全浸湿，这样才能将其管壁上残留的示踪剂一并清除，将轻轻液体倒出。
随后同量冲洗4次，将液体轻轻倒出。
6.最后一次冲洗完后，将管口倒置于干净的滤纸上约5～10分钟，然后轻轻敲打管口排净残留的液体。
7.将所有试管按检测顺序（仪器提示顺序）放入化学发光计内进行检测。测定前，确认待测管外壁上没有冲洗液。否则会因管子不能进入测定室，而导致程序无法运行。
8.检测仪自动注射300μl的LUMItest Basiskit试剂1、2开始检测。建议每管样品测量时间为1秒。
9.检测流程 标准曲线方案。
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仪器菜单
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输入
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MEASURE
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PROTOCOLS
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ENTERPROTOCOL NO.
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输入程序编号，enter
PRINTLIST:打印程序列表
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PROTOCOL O.K.? PCT
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显示所选程序名
YES确认该程序
NO回到上一显示项
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USE LAST STANDARDIZATION?
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NO（重新建立标准曲线）
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COMMENT
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输入注释（如化验号），enter
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按屏幕提示信息依次插入标准管、对照管和患者标本管
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Insert TUBE STR1
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插入第1管标准管S1
START:提示按START键，开始检测
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转子带第1管进入测定室
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Insert TUBE STR2
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插入第2管标准管S2
START:提示按START键，开始检测
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转子带第2管进入测定室
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转子带第1管返回
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REMOVE:取出已完成检测的第1管
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以此类推，直至完成标准管S6检测
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续表
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仪器菜单
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输入
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STANDARD CURVE
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CONTINUE确认标准曲线，返回检测
CHANGE修改曲线
PRINT打印曲线图
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Insert TUBE CRL1
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插入对照管K1
START:提示按START键，开始检测
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同上，完成对照管K1、K2检测
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Insert TUBE P1
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插入患者标本管
START:提示按START键，开始检测
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同上，直至完成最后一个标本检测
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EXIT
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退出程序
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【参考范围】
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PCT浓度（ng／ml）
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解释
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建议
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＜0.05
＜0.25
＜0.25
＜0.5
0.5～2.0
2.0～10.0
＞10.0
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正常人
基本没有细菌感染的可能
通过治疗低于此浓度
不可能是脓毒症或感染性休克，局部感染不除外
需要动态观察，可能存在感染或败血症；不可能是严重的败血症或感染性休克
存在严重的细菌感染，除非有其他已知原因
如果可以除外严重多发创伤，即可证明存在严重细菌感染伴随全身炎症反应（如脓毒症伴器官功能衰竭或休克）
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不必使用抗生素
停用抗生素
密切观察临床表现，必要时进行其他辅助检查
明确病原学诊断，寻找病灶；有严重感染或脓毒症的可能，建议6～12小时后再进行复查
明确病原学诊断，密切监测；寻找病灶，必要时可给予特异抗感染治疗和支持治疗
明确病原学诊断；寻找病灶，给予特异抗感染治疗和支持治疗
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【临床意义】
降钙素原检测主要用于怀疑全身性细菌感染患者的早期诊断；鉴别诊断细菌感染还是非细菌感染引起的不明原因发热；脓毒症患者抗生素使用后的疗效观察及病情监测；帮助决定是否使用抗生素治疗，或停止使用抗生素治疗等方面。金标法相对于仪器法具有快速检测的优势，对于临床危、急、重患者可疑细菌性感染具有重要的应用价值。
【标本要求】
1.采血清或血浆。
2.抽血后24小时如不能检测，须冷冻并贮藏在-20℃以下。血样可以冻融3次。
【方法与原理】
The B·R·A·H·M·S PCT-Q是一种用于半定量的检测降钙素原PCT的免疫色谱检测法，可用于诊断和控制严重的细菌感染和败血症的治疗。B·R·A·H·M·SPCT-Q是一种只需要孵育30分钟的检测系统，既不依赖仪器，又不需要校准。该测定是利用一个标记有胶体金的抗cata-calcin单克隆小鼠抗体（示踪剂）和多克隆绵羊抗降钙素抗体（固相）做检测。患者的样品（血清或血浆）加到检测孔后，示踪元素就合到样品中的PCT，形成标记的抗原抗体复合物。这个复合物在检测系统中借助于毛细作用移动通过含有检测带的区域，在此过程中，标记的抗原抗体复合物就结合到固相的抗降钙素的抗体上，形成一个夹心式的复合物。当PCT浓度≥0.5ng/ml，这个复合物呈淡红色的条带。条带的颜色强度直接与样品中PCT的浓度成正比，与参考卡片上提供的PCT浓度范围相关：＜0.5ng/ml、≥0.5ng/ml、≥2ng/ml、≥10ng／ml。没有结合PCT的示踪剂扩散到对照条带区，在那里被固定，能产生非常强烈的红色条带，这个检测系统的功能是通过这条对照带来测定的。可与比色卡的颜色对照对PCT浓度作定量测定，其在0.1～500ng/ml范围内有效。
【试剂】
每个试剂盒可用于进行25次试验。
1.检测装置，25包。
每个检测装置用具有保护性的包装材料密封，里面包含：
（1）1个检测卡。
（2）1个一次性塑料移液管。
（3）1个干燥包。
2.参考卡片，25个。
3.使用说明书，1份。
【操作步骤】
1.每次检测均要使用新的检测用品。在开始检测前，所有的检测用品需置于室温并达到室温。每个检测包装在要检测前打开。
2.用附带的移液管把6滴或200μl血清或血浆滴加到B·R·A·H·M·S PCT-Q的圆孔中。滴加时轻微地倾斜吸管，不要产生气泡。
3.在室温下孵化30分钟。
4. 30分钟之后（最长45分钟），确定样本中PCT的浓度。
【性能参数】
1.精确性和准确性
（1）90%～92%诊断灵敏度和92%～98%的特异度。在得到阳性结果的情况下，如果需要精确测定临床观察或每日PCT浓度的，建议随后使用评细替一LIA进行测定。
（2）作为一种半定量的检测系统，B·R·A·H·M·S PCT-Q就单独每个浓度范围与B·R·A·H·M·S PCT LIA密切相关。由于存在读数方面的个体差异B·R·A·H·M·SPCT-Q与LUMI-testⓇ PCT之间的差异是可能存在的，特别在接近代表参考色带的PCT浓度时。
2.“高钩”效应PCT浓度超过4000ng／ml时对校正的相关浓度范围没有影响。
3.干扰
（1）血红蛋白浓度＞5g/dl会限制读数的准确性，以致影响检测结果。
（2）严重溶血的样品不能用于B·R·A·H·M·S PCT-Q的检测。
（3）脂肪和胆红素对检测结果没有影响。
（4）个别人血清中高浓度的人抗动物免疫球蛋白对示踪剂有干扰，因此会有假阳性结果（HAMA效应）。
【参考范围】
注意：判断应当根据临床情况。因此，临床医生应当把PCT的结果和其他实验室结果以及患者的临床症状联系起来，并联系患者的临床情况解释测得的值。本检测所列的参考范围只是起一个定向的作用。
1.PCT＜0. 5ng/ml
（1）可能有局部细菌感染，注意：PCT的水平低于0.5ng／ml并不排除感染，因为局部感染（没有全身症状）可能有这么低的水平。在细菌感染早期（通常在6小时以内）用PCT检测，所测得的值也可以很低，在这种情况下，PCT应当在6～24小时之后重新评估一下。
（2）不可能是全身感染（败血症），进展成全身重度感染（脓毒败血症）有低度的危险。
2. PCT≥0. 5ng／ml且＜2 ng／ml
（1）可能有全身感染（败血症）。进展成全身重度感染有中度的危险可能性。
（2）但其他不同的情况也可能引起PCT增高。患者在临床上应当密切监护，而且在6～24小时之内应当用PCT再评估。
3. PCT≥2ng/ml且≤10ng/ml
可能有全身感染，除非有其他已知原因。有进展成全身重度感染的高度危险。
4.PCT≥10ng／ml
重要的全身炎症反应，几乎可以肯定是重度细菌感染或感染性休克引起的。很可能进展成全身重度感染或感染性休克。
【临床意义】
（1→3）-β-D-葡聚糖是除接合菌外所有真菌（包括念珠菌属、曲霉、镰孢菌属、酵母菌、毛孢子菌属、支顶孢属等）细胞壁的特有成分，而原核生物、病毒和人类细胞壁均不含此多糖。对血浆中（1→3）-β-D-葡聚糖的检测，可以实现侵袭性真菌（不包括接合菌和隐球菌）感染的早期诊断，其阳性时间早于感染临床表现和高分辨CT等影像学变化。另外，血浆中（1→3）-β-D-葡聚糖浓度的动态变化，还可以反映临床抗真菌治疗的效果。
【标本要求】
无热源、肝素类抗凝静脉采血管，3小时内送检。
4～8℃可保存48小时，-70℃保存2年，仅可反复冻融4次（尽可能不使用冻融标本）。
【方法与原理】
血浆中的（1→3）-β-D-葡聚糖与鲎试验中G因子发生凝固反应，形成凝固蛋白，动态检测其引起的浊度变化，计算（1→3）-β-D-葡聚糖含量。
【仪器】
1.MB-80微生物快速动态检测系统。
2.恒温仪。
3.振荡器。
4.加样器。
5.无热原加样头。
6.无热原平底玻璃反应管。
【试剂】
真菌（1→3）-β-D-葡聚糖检测试剂盒（北京金山川科技发展有限公司）。
1.含有凝固蛋白酶的反应主剂C，规格0. 2ml／支×5支／盒。
2.样品处理液D，规格0. 9ml／支×5支／盒。
3.试剂贮存2～8℃避光保存，禁止冻结，有效期3年。
【操作步骤】
1.仪器预热打开恒温仪和MB-80微生物快速动态检测仪，使其分别预热至70℃和36. 5～37℃。
2.信息录入运行微生物快速动态检测系统程序，进入“数据采集”单元，填写试剂批号、保留文件名称（一般为检测日期）、室温，设定检测时间为5400秒，录入标本信息。
3.血浆制备用无热原一次性真空采血管（肝素钠抗凝）采静脉血2ml，3000转／分钟离心1分钟，分离得富血小板的血浆。血浆可以- 20℃保存1个月。
4.样本处理
（1）取上述血浆0.1ml，加入0.9ml样品处理液D中，混匀，70℃保温10分钟，取出后立即放入冰水浴冷却。
（2）取冷却后的样品0.2ml，加入酶反应主剂C中，溶解后全部转移至10mm×75mm无热原平底玻璃反应管中，尽量不要产生气泡。 5.样品检测 点击程序采集键，命令MB-80微生物快速动态检测仪开始采集数据。按标本信息栏所示标本顺序将玻璃反应管插入检测仪的检测孔中，注意要一次性插到孔底，此时检测孔旁指示灯亮起，插入后不可再转动反应管，否则检测将中止。
6.结果读取检测完成后程序会提示“反应结束”，检测曲线窗口变为黄色。点击“返回”键回到主菜单，进入“数据分析”单元。点击打开文件夹图标，打开所保存数据文件，点击“数据报告”即可读取检测结果。
【性能参数】
1.灵敏度 最小检出值5pg/ml。
2.精密度 批间CV＜10%。
3.准确性 平均回收率75%～125%。
4.标准曲线范围 5～9000pg／ml。
5.相关系数 |r|≥0. 980。
【参考范围】
1.＜10pg/ml阴性。
2. 10～20pg／ml建议动态观察。
3.＞20pg／ml阳性。
【临床意义】
难辨梭菌是革兰阴性厌氧杆菌，是常见的医院内病原菌，能导致腹泻和抗生素相关性伪膜性肠炎。20世纪60～70年代，抗生素相关性伪膜性肠炎成为了一个重要的临床问题，主要是由于青霉素类和头孢菌素类广谱抗生素的应用。1977年Larson等报道，感染患者的粪便中含有一种毒素，能够使培养的细胞发生病变，而后产生该毒素的细菌被确定为难辨梭菌。
难辨梭菌至少可以产生2种毒素A和B。毒素A（mwt. 308kDa）能导致液体分泌、黏膜损伤和体内炎症。毒素B（mwt. 250kDa）的细胞毒性比毒素A约强1000倍，但它不是肠毒素。因此，普遍认为毒素A在难辨梭菌的致病性中起更重要的作用。
毒素A与B是同时产生的。疾病症状主要由毒素A引起，而毒素B与毒素A起相互促进的作用。
当难辨梭菌感染结肠时，会产生导致腹泻和伪膜性肠炎的毒素。其感染通常是医院内感染，一旦造成暴发流行，很难控制，且患者易反复感染。针对难辨梭菌的抗生素治疗有助于疾病治疗。
临床上同时检测毒素A和B的重要性还没有得到充分了解。由于大多数致病株同时产两种毒素，这两种毒素是协同作用的，同时检测毒素A和B是非常重要的。
本检测试剂采用酶联荧光免疫分析技术（ELFA），应用VIDAS自动化仪器对大便标本中的难辨梭菌毒素A和B进行定性检测，协助诊断难辨梭菌相关性疾病（CDAD）。
【标本要求】
根据实验室标准程序采集大便标本并储存于2～8℃待处理。标本采集后应存放在适当的塑料容器中并尽快送实验室。大便标本制备前在2～8℃可保存最多3天。标本在-25℃±6℃冷冻可保存1个月或-70℃（或更低温度）保存1个月以上。
【方法与原理】
检测采用两步酶免夹心法与终点荧光检测相结合技术（ELFA）。
固相管（SPR）具有两种作用：固相载体和加样。检测试剂随时可用且预先加在了密封的试剂条内。
仪器自动完成4个检测步骤。反应液在SPR内外循环数次。每步反应后开始清洗循环以除去未结合成分。
1.标本中的毒素A和（或）B与SPR内面包被的抗毒素A抗体（兔多克隆）和B抗体（鼠单克隆）特异性结合。
2.毒素A与标记生物素的抗毒素A抗体（鼠单克隆）结合，毒素B与标记生物素的抗毒素B抗体（鼠单克隆）结合。
3.碱性磷酸酶标记的链霉亲和素与生物素共同孵育以检测生物素。
4.检测碱性磷酸酶将底物（4-甲基伞形酮磷酸酯）水解为可用450nm波长检测的荧光产物（4-甲基伞形酮）。
荧光强度与标本中毒素A和（或）B的含量成正比。
VIDAS难辨梭菌毒素AB试验完成后仪器自动分析结果，给出试验值并打印每份标本的结果。
【仪器】
Mini VIDAS（法国生物梅里埃）
【试剂】
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60个难辨梭菌毒素AB试剂条
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STR
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随时可用
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60个难辨梭菌毒素ABSPR（2×30）
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SPR
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随时可用。难辨梭菌兔多克隆抗毒素A抗体和鼠单克隆抗毒素B抗体
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1瓶标准
（1×4ml）（液体）
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Sl
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用0.05mol／LTRIS缓冲液（pH7.2）+5%BSA+防腐剂稀释的难辩梭菌A毒素
|
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1瓶A毒素阳性质控
（1×4ml）（液体）
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Cl
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用0.05mol／LTRIS缓冲液（pH7.2）+5%BSA+防腐剂稀释的难辨梭菌A毒素
试验值范围标在MLE卡上：质控C1（+）试验值范围
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1瓶阴性质控
（1×4ml）（液体）
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C2
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0.05mol/LTRIS缓冲液（pH7.2）+5%BSA+防腐剂
试验值范围标在MLE卡上：质控C2（-）试验值范围
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续表
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60个难辨梭菌毒素
AB试剂条
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STR
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随时可用
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1瓶B毒素阳性质控
（1×4ml）（液体）
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C3
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用0.05mol/LTRIS缓冲液（pH7.2）+5%BSA+防腐剂稀释的难辨梭菌B毒素
试验值范围标在MLE卡上：质控C3（+）试验值范围
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1瓶标本稀释液
（1×61ml）（液体）
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R1
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随时可用。0.05mol/LTRIS缓冲液（pH7.2）+50%小牛血清+去污剂+防腐剂
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1张MLE卡
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含各种参数，包括厂家提供的校正数据用于校正试验
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1份试剂盒说明书
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||
【操作步骤】
1.标本前处理
（1）液态粪便：用移液管将200μl液体大便加入一清洁离心管中。 （2）固体或半固体粪便：为准确取200mg半固体或固体大便，首先取200μl蒸馏水加入一清洁离心管，作为“参照管”；另取一清洁离心管作为标本管，用洁净木棍挑取一定量大便（200mg）加入标本管，所取大便体积与“参照管”液面相同即可。用环搅拌标本，使其在稀释液中形成悬浊液。
（3）离心管中加入1000μl标本稀释液（Rl）。
（4）标本置漩涡振荡器彻底混匀。标本与标本稀释液（Rl）一定要混匀。
（5）离心：2～25℃最小12 0009 5分钟。
（6）至少取300μl上清用于VIDAS难辨梭菌毒素AB检测。
注意：离心后如上清表面仍有颗粒物或脂肪，吸取上清时加样头应伸入表面以下。
2.检测程序
（1）从冰箱取出所需数量的试剂，每份标本、质控或标准对应用1个CDAB试剂条和1个CDAB SPR。取出所需SPRs后务必将铝箔袋再次密封好。
（2）键入或选择“CDAB”输入CDAB检测代码。标准为S1做双份。如果做阳性质控，分别为“C1”和“C3”。如果做阴性质控为“C2”。
（3）将制备好的标本、S1、C1、C2、C3 300μl分别加入标本孔内。
（4）确认SPR和试剂条彩色标识匹配后才能放入仪器中。
（5）参照操作手册开始检测。仪器自动完成检测分析过程。整个检测大约需75分钟。
（6）检测完成后从仪器取出SPR和试剂条。
（7）用过的SPR和试剂条放入适当容器中处理。
【参考范围】
每份标本，仪器读取二次荧光值。第一次读取的是底物与酶结合前透明小管的背景荧光值；第二次读取的是底物与酶结合后的荧光值。相对荧光值（RFV）是除去背景值的最终检测结果，将显示在报告单上。
每份标本的检测值计算如下：检测值一患者RFV／标准RFV。
检测值及结果解释会显示在报告单上。根据检测值得出的结果解释如下：
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检测值
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结果
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＜0.13
≥0.13＜0.37
≥0.37
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阴性
可疑
阳性
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如出现可疑检测结果，应再次留取标本重新检测CDAB。结合患者临床表现和病史必须在2周内采集标本。如结果仍然可疑，应改用其他方法检测。
若背景值超过cut-off值，检测结果视为无效，表示底物可能受到污染。结果无效的标本应用原上清液再次检测或条件允许时重新采集新鲜标本检测。
对检测结果的解释应结合患者病史和其他检测项目综合分析。
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