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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验71-80

作者:王泓  日期:2014-06-19

 

    【临床意义】
    阳性提示巨细胞病毒近期感染。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附实验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay，ELISA）。
    2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被巨细胞病毒抗原成分的酶免疫反应板上，首先用含有欧蒙IgG／RF吸附剂的缓冲液稀释标本，去除标本中的IgG和RF，以检测特异性IgM。在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗巨细胞病毒抗原成分的抗体，则可以特异性地和酶免疫反应板上的巨细胞病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗巨细胞病毒抗原抗体浓度成正比，可根据试剂盒中标准血清测定结果半定量计算出患者标本中抗巨细胞病毒抗原抗体浓度。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    欧蒙公司，试剂盒组成如下：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆
分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgM，人），直接使用
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0.5 mol/L硫酸，直接使用
—
 
 
浅红
 
蓝色
 
绿色
 
绿色
 
浅蓝
 
无色
 
无色
 
无色
12×8
 
 
1×2. 0ml
 
1×2. 0ml
 
1×2. 0ml
 
1×12ml
 
1×100ml
 
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
Strips
 
 
CAL 3
 
Pos controL
 
Neg control
 
Conj ugate
 
Sample buffer
 
Wash buffer 10×
 
Substrate
 
Stop solution

    【操作步骤】
    1.标本稀释 用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本。可取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀），室温静置30分钟。
    2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
    3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
    5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
    6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    7.清洗 同第4步骤清洗。
    8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
    9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
    10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
    11.比色 450nm比色波长，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
    12.结果判定
    半定量：按以下公式计算对照血清或患者标本吸光度与标准品吸光度的比值。
    半定量估计结果：比值=对照血清或患者标本的吸光度值／标准品的吸光度值。
    【参考范围】
    1.标本抗巨细胞病毒抗体ISR值小于0.8为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.8到1.1之间是灰区。
    2.结果在阳性或灰区的标本需用Trinity的巨细胞病毒抗体IgM诊断试剂盒进行复检。最终结果判断如下：

欧蒙
Trinity
最终结果
+
+
+
+
灰区
灰区，建议复查
+
-
-
灰区
+
灰区，建议复查
灰区
灰区
灰区，建议复查
灰区
-
-

    【临床意义】
    HSVl-IgM抗体阳性提示HSV1近期感染。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附实验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay，ELISA）。
    2.原理稀释后的待检血清滴加在包被单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原成分的酶免疫反应板上，首先用含有IgG/RF吸附剂的缓冲液稀释标本，去除标本中的IgG和RF，以检测特异性IgM。在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原成分的抗体，则可以特异性地和酶免疫反应板上的单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原抗体浓度成正比，可根据试剂盒中标准血清测定结果半定量计算出患者标本中抗单纯疱疹病毒（HSV-1）抗原抗体浓度。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
   【试剂】
    欧蒙公司，试剂盒组成如下：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆
分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgM，人），直接使用
—
 
 
浅红
12×8
 
 
1×2. 0ml
Strips
 
 
CAL 3

    续表

成分
颜色
规格
代码
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0.5 mol／L硫酸，直接使用
蓝色
 
绿色
 
绿色
 
浅蓝
 
无色
 
无色
 
无色
1×2. 0ml
 
1×2. 0ml
 
1×12ml
 
1×100ml
 
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
Pos control
 
Neg control
 
Conj ugate
 
Sample buffer
 
Wash buffer 10×
 
Substrate
 
Stop solution

    【操作步骤】
    1.标本稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本。可取10μl血清用1. 0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀），室温静置30分钟。
    2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
    3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
    5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
    6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    7.清洗 如第4步骤清洗。
    8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
    9.温育室温（18～25℃）避光温育15分钟。
    10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
    11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
    12.结果判定
    半定量：按以下公式计算对照血清或患者标本吸光度与标准品吸光度的比值。
    半定量估计结果：比值一对照血清或患者标本的吸光度值／标准品的吸光度值。
    【参考范围】
    1.标本抗单纯疱疹1型病毒抗体ISR值小于0.8为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.8到1.1之间是灰区。
    2.结果在阳性或灰区的标本需用Trinity的单纯疱疹1型病毒抗体IgM诊断试剂盒进行复检。最终结果判断如下：

欧蒙
Trinity
最终结果
+
+
+
+
灰区
灰区，建议复查
+
-
-
灰区
+
灰区，建议复查
灰区
灰区
灰区，建议复查
灰区
-
-

    【临床意义】
    HSV2-IgM抗体阳性提示HSV2近期感染。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【方法与原理】
    1.方法酶联免疫吸附实验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay，ELISA）。
    2.原理稀释后的待检血清滴加在包被单纯疱疹病毒（HSV-2）抗原成分的酶免疫反应板上，首先用含有IgG／RF吸附剂的缓冲液稀释标本，去除标本中的IgG和RF，以检测特异性IgM。在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗单纯疱疹病毒抗原成分的抗体，则可以特异性地和酶免疫反应板上的单纯疱疹病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗单纯疱疹病毒抗原抗体浓度成正比，可根据试剂盒中标准血清测定结果半定量计算出患者标本中抗单纯疱疹病毒抗原抗体浓度。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    欧蒙公司，试剂盒组成如下：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆
分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgM，人），直接使用
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0. 5mol／L硫酸，直接使用
—
 
 
浅红
 
蓝色
 
绿色
 
绿色
 
浅蓝
 
无色
 
无色
 
无色
12×8
 
 
1×2. 0ml
 
1×2. 0ml
 
1 ×2. 0ml
 
1×12ml
 
1×100ml
 
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
Strips
 
 
CAL 3
 
Pos control
 
Neg control
 
Conj ugate
 
Sample buffer
 
Wash buffer 10×
 
Substrate
 
Stop solution

    【操作步骤】
    1.标本稀释 用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本。可取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀），室温静置30分钟。
    2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
    3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
    5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
    6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    7.清洗 如第4步骤清洗。
    8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
    9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
    10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
    11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
    12.结果判定
    半定量：按以下公式计算对照血清或患者标本吸光度与标准品吸光度的比值。
    半定量估计结果：比值=对照血清或患者标本的吸光度值／标准品的吸光度值。
    【参考范围】
    1.标本抗单纯疱疹2型病毒抗体ISR值小于0.8为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.8到1.1之间是灰区。
    2.结果在阳性或灰区的标本需用Trinity的单纯疱疹2型病毒抗体IgM诊断试剂盒进行复检。最终结果判断如下：

欧蒙
Trinity
最终结果
+
+
+
+
灰区
灰区，建议复查
+
-
-
灰区
+
灰区，建议复查
灰区
灰区
灰区，建议复查
灰区
-
-

    【临床意义】
    阳性提示单纯疱疹病毒1型和（或）2型急性感染。
    【标本要求】
    标本的采集和固定：挑破水泡，将拭子用力涂擦破损部位基底面以获得尽可能多的感染细胞，压挤方式滚动涂片，每份标本涂片2张，丙酮室温固定10分钟。
    【方法与原理】
    1.方法 直接免疫荧光法。
    2.原理 荧光素标记的单克隆抗体滴加在涂片上，如果标本中存在单纯疱疹病毒1型或2型抗原，即与荧光单抗结合，否则被PBS洗去。结合荧光单抗的单纯疱疹病毒1型和2型感染细胞在荧光显微镜下呈荧光染色。
    【仪器】
    日本Nikon公司Diaphot-200荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax2020型洗涤摇床。
    【试剂】
    丹麦Dako公司产品，荧光素（FITC）标记的单纯疱疹病毒1型和2型单克隆抗体（IMAGEN-rM Herpes Simples Virus）。
    【操作步骤】 将荧光素标记的抗单纯疱疹病毒1型和2型单克隆抗体分别滴加于临床标本涂片上（1型和2型各一孔），37℃湿盒内温育30分钟。PBS洗涤2次，每次2～3分钟，再用蒸馏水冲洗玻片1次，以除去盐分，电风扇吹干，封片后在荧光显微镜下（×200）观察结果。阳性结果可见细胞膜、细胞质或细胞核荧光染色。
    【参考范围】
    阴性。
    【临床意义】
    阳性提示麻疹病毒近期感染。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）。
    2.原理 用纯化的麻疹病毒抗原包被微孔，将待检稀释血清标本加入微孔，若其中含抗麻疹病毒IgM，则与包被在微孔上的抗原结合。当微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgM抗体，其与微孔中的抗麻疹病毒IgM结合，最后辣根过氧化物酶催化加入微孔的酶底物反应，呈现蓝色，加入终止液后呈黄色。使用酶标仪测定其吸光度值。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    Trinity公司，试剂盒组成如下：

成分
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可拆分的微孔，直接使用
2.校准液
需稀释
3.阳性质控
需稀释
4.阴性质控
需稀释
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM，直接使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
20倍浓缩
8.TMB/底物液
直接使用
9.终止液
直接使用
12×8
 
 
1×0.4ml
 
1×0.04ml
 
1×0.4ml
 
1×16ml
 
2×45ml
 
1×60ml
 
1×15ml
 
1×15ml
Antigenscoatedmicroassayplate
 
 
Calibrator
 
Positivecontrol
 
Negativecontrol
 
HRPconjugate
 
Serumdilutionplus
 
Washbuffersolutiontype
 
Chromogen/substratesolutiontype
 
Stopsolution

    【操作步骤】
    1.实验前处理
    （1）实验前将试剂盒和标本等放置在实验台平衡至室温（21～25℃），摇匀试剂盒内的各种试剂。
    （2）将浓缩洗液（60ml）用蒸馏水稀释为1.2L工作洗液，混匀。
    （3）待检血清标本，阳、阴性质控和校准物稀释：以1: 81用血清稀释液稀释（10μl标本+800μl血清稀释液）。脑脊液标本用稀释液以1：10稀释。
    2.检测过程
    （1）取出需要数量的微孔板条，第一条第一空设空白对照。
    （2）在相应微孔中加入100μl稀释后的阳性、阴性质控，校准及患者标本。在空白孔中加入100μl血清稀释液。
    （3）将微孔板置于21～25℃室温孵育（30±2）分钟。
    （4）用洗板机洗涤微孔板条5次，每次浸泡20秒左右。
    （5）洗毕后在纸巾上拍尽残余洗液。
    （6）将所有微孔中加入100μl酶结合物（空白孔不加）。
    （7）轻拍摇动微孔条，在21～25℃室温孵育（30±2）分钟。
    （8）重复第4、5洗涤、拍干步骤。
    （9）将所有微孔中加入100μl TMB底物液。
    （10）轻拍摇动微孔条，21～25℃室温孵育（15±2）分钟。
    （11）将所有微孔中加入100μl终止液，轻拍摇匀微孔条。
    （12）5分钟后，1个时内用酶标仪（450nm波长）检测各孔吸光度。
    （13）阴性质控吸光度应＜0. 250；校准应≥0.300；阳性质控应＞0. 250。阴性质控、阳性质控吸光值应在瓶外所标示范围内。
    3.结果计算
    （1）校准平均吸光度值=两校准孔吸光度值之和除以2。
    （2）校准因子（用于校准由于室温和孵育时间的波动等引起的实验误差）见瓶标。
    （3）临界值=校准平均吸光度值×校准因子。
    （4）ISR值=标本吸光度值／临界值
    如：校准OD分别为0.38和0.42
    平均校准OD=0. 40
    校准因子=0. 50
    临界值=0. 50×0.40=0.2
    患者标本OD=0. 60
    ISR值=0.60/0.20=3.00
    【参考范围】

ISR值
结果
解释
＜0.9
0.91～1.09
＞1.10
阴性
未能确定
阳性
未检测到麻疹病毒IgM
应重检测
可能检测到一定浓度的麻疹病毒IgM，提示新近感染

    抗麻疹病毒抗原抗体IRS小于0.9为阴性；大于1.1是阳性；IRS在0.9到1.1之间是灰区，建议再取一份患者标本做重复实验。
    【临床意义】
    1.对于任何衣原体种，IgG≥1: 16但＜1: 512，且IgM抗体阴性提示衣原体既往感染。
    2.衣原体IgG抗体滴度≥1: 512阳性和（或）IgM抗体≥1: 32阳性，提示衣原体近期感染；急性期和恢复期双份血清IgG抗体滴度4倍及以上升高也提示衣原体近期感染。
    3.沙眼衣原体血清学适用于：沙眼衣原体生殖道播散性感染（附睾炎、子宫内膜炎、输尿管炎及盆腔炎）；新生儿沙眼衣原体肺炎（分娩时胎儿通过沙眼衣原体感染的宫颈）；性病淋巴肉芽肿；沙眼衣原体全身系统性感染且合并变态反应，如Fitz-Hugh-Curtis综合征（肝周炎）、Reiter综合征等实验室诊断。
    4.肺炎衣原体血清学适用于：肺炎衣原体所致的下呼吸道感染，如气管支气管炎和肺炎的诊断。由于肺炎衣原体下呼吸道感染临床症状和体征无特异性，实验室检测是确诊的依据。临床标本肺炎衣原体分离极为困难，因此，血清学是主要诊断方法。微量免疫荧光试验（micro-immunofluorescence， MIF）是国际上最常用的肺炎衣原体血清学方法，已成为美国CDC推荐方法。
   5.鹦鹉热衣原体血清学适用于：人类鹦鹉热的实验室诊断。目前人类鹦鹉热发病率随饲养宠鸟人数的增加有所增加，但总发病率仍然较低。鹦鹉热通常呈不典型肺炎的临床表现，往往发生在接触受染的鸟类（疫鸟）和低等的哺乳类动物。临床症状可以是轻度的或一过性的流感样症状，也可是急性发病，伴有高烧，剧烈的头痛和肺炎，后者可发展为谵妄，低氧血症甚至死亡。鹦鹉热累及心脏时，心电图呈心肌炎改变。另外，鹦鹉热临床表现还可有贫血、反应性肝炎、肝脾肿大、蛋白尿等。鹦鹉热肺部X线主要表现不同程度的肺部浸润，无特异性。
    【标本要求】
    普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存于-20℃保存。
    【方法与原理】
    1.方法间接免疫荧光法。
    2.原理稀释后的待检血清滴加在沙眼衣原体、肺炎衣原体及鹦鹉热衣原体抗原基质上，如果标本中存在抗体，即与抗原结合，否则被PBS洗去。结合在衣原体抗原上的第一抗体（血清抗体）再与加入的第二荧光抗体结合，如羊或兔抗人免疫球蛋白IgG或IgM荧光抗体，在荧光显微镜下显示荧光染色的衣原体。
    【仪器】
    日本Nikon公司Diaphot-200荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax2020型洗涤摇床。
    【试剂】
    1.抗原沙眼衣原体L2／434/Bu株、肺炎衣原体CWL-029（ATCCVR 1310）株和鹦鹉热衣原体6BC株接种BGMK细胞株（绿猴肾细胞），超声波破碎感染细胞，释放衣原体，阶层梯度密度离心纯化衣原体抗原（EBs）。将纯化的沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体抗原分别滴涂在特殊印制的28孔载玻片上，丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在- 20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    2.结合物 兔抗人IgG和羊抗人IgM荧光抗体（Sigma公司产品）。原液分装冻存- 20℃冰箱。使用时取一管化冻，用0.01mol／L的PBS（pH7.2，含0. 025% Evans蓝和0.05%叠氮钠）稀释至工作浓度（稀释度按说明书或方阵预滴定），稀释后的结合物在2～8℃可保存1～2月。
    【操作步骤】
    试验前将含抗原片的锡纸口袋自-20℃冻箱内取出，置室温至少15分钟，然后剪开锡纸口袋，取出抗原片。待检血清（包括阳性和阴性对照）用0. 01mol／L浓度的PBS（pH7.2）做1: 16、1：64、1: 256、1：512稀释，然后滴加在28孔抗原片上。37℃湿盒内温育30分钟（检测IgM抗体温育90分钟）。PBS洗涤2次，每次2～3分钟，再用蒸馏水冲洗玻片1次，以除去盐分，电风扇吹干。加入工作浓度的兔抗人IgG或IgM荧光抗体，37℃湿盒内温育30分钟（检测IgM抗体也温育30分钟）。同样方法洗涤玻片，甘油封片，荧光显微镜下（×200）观察结果。无论是检测IgG或IgM抗体，镜下见致密、沙粒状颗粒（衣原体原体）荧光染色为阳性。
    对于IgM抗体阳性的血清标本，需要进行类风湿因子（RF）吸收试验（另见操作规程），然后重复上述步骤进行检测，结果以吸收后的为准。确定滴度时应考虑到吸收试验过程中时血清的稀释。衣原体IgG抗体阴性，但IgM抗体阳性，RF乳胶吸附试验后IgM抗体仍为阳性，应考虑窗口期的存在。处理方法：2周后复查衣原体IgG和IgM抗体，如果IgG抗体阳转，则为窗口期，判断为近期感染。如果复查IgG抗体仍然为阴性，则考虑IgM抗体假阳性。
    【参考范围】
    对于任何衣原体种（沙眼、肺炎及鹦鹉热），血清IgG抗体滴度＜1：512，IgM抗体为阴性属于正常范围。
    【临床意义】
    肺炎支原体抗体滴度≥1: 160为阳性提示肺炎支原体近期感染。
    【标本要求】
    普通管静脉血标本2ml，常规分离血清，如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。
    【方法与原理】
    1.方法颗粒凝集法。
    2.原理 包被肺炎支原体膜抗原的明胶颗粒在抗体存在条件下发生凝集反应。
    【仪器】
    微量振荡器。
    【试剂】
    日本Fujirebio公司产品Serodia-MycoⅡ。
    1.U形微孔反应板。
    2.血清标本稀释液，100ml/瓶×1瓶，工作浓度。
    3.致敏的明胶颗粒（冻干），加入血清标本稀释液溶解，1. 5ml／瓶×5瓶。
    4.非致敏的明胶颗粒（冻干），加入血清标本稀释液溶解，0. 5ml／瓶×3瓶。
    5.阳性抗体对照，即兔抗肺炎支原体抗体，0. 5ml／瓶×1瓶。
    【操作步骤】
    1.试验前将所有试剂和材料置于室温15分钟。
    2.待检血清做1: 80稀释，分两步进行。第一步：1: 20稀释血清，5μl血清+95μl稀释液，混匀。第二步：取25μl的1: 20稀释的血清+75μl稀释液，再混匀即为1：80稀释。
    3.阳性对照血清做1: 10稀释，即10μl血清+90μl稀释液，混匀。阴性对照为血清标本稀释液。
    4.取1：80稀释的待检血清，1: 10稀释的阳性对照血清和阴性对照（血清标本稀释液）及弱阳性对照血清分别加入U形板内，每孔25μl，再加入肺炎支原体抗原致敏的明胶颗粒悬液，每孔25μl，振荡混匀，这样待检血清实际为1：160稀释，封上防蒸发胶带，置于室温3小时后观察结果。
    5.结果评定标准根据Fujirebio公司凝集反应图形进行。
    6.待检血清1: 160稀释凝集阳性时，必须进行非特异性凝集试验：待检血清稀释方法同上，稀释后的待检血清加入U形板内，每孔25μl，再加入非致敏的明胶颗粒悬液，每孔 25μl，振荡混匀，封上防蒸发胶带，置于室温3小时后观察结果。
    7.如果非特异性凝集试验阴性，上述1：160稀释凝集阳性的待检血清为真阳性，提示肺炎支原体近期感染。
    【参考范围】
    正常人可能存在肺炎支原体抗体，但滴度＜1：160。
    【参考文献】
    1. Abele-Horn M，Busch U，Nitschko H，et aI.Molecular approaches to diagnosis of pulmonary diseases due to MycoPlasma pneumoniae.J Clin Microbiol，1998，36:548-551
    2.Tjhie J H，Van Kuppeveld F J，Roosendaal R，et al.Direct PCR enahles detection of Myco plasma pneumoniae in Patients with respiratory tract infectionsJ Clin Microbl01，1994，32:11-16
    【临床意义】
    阳性提示CMV急性感染。CMVpp65阳性结果实行危急报告制度，即打电话通知临床医生，以便尽早使用抗CMV药物治疗。
    【标本要求】
    EDTA-K3抗凝的静脉血2～5ml，白细胞过低患者，如＜200个／mm3，需要采集5～10ml抗凝的静脉血。
    【方法与原理】
    1.方法 间接免疫荧光法。
    2.原理 两种抗CMV低基质结构磷蛋白（lower matrix structural phos- phoprotein，CMVpp65抗原）的单克隆抗体滴加在固定后的纯化的白细胞涂片上，如果白细胞核中存在CMV抗原，即与单克隆抗体结合，否则被PBS洗去。结合CMV抗原的单克隆抗体再与加入的第二荧光抗体结合，如羊或兔抗鼠免疫球蛋白IgG荧光抗体，在荧光显微镜下显示荧光染色的白细胞核（CMV抗原）。
    【仪器】
    英国Shandon公司Cytospin3型细胞离心涂片机、日本Nikon公司Dia-phot-200荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax 2020型洗涤摇床。
    【试剂】
    荷兰IQ公司产品（CMV BriteTMKit）。
    1.试剂A 6%右旋糖酐。
    2.试剂B 溶血素。
    3.试剂C 固定液。
    4.试剂D 打孔液。
    5.试剂E 浓缩的洗液。
    6.试剂F 鼠抗CMVpp65抗原的单克隆抗体。
    7.试剂G 抗鼠IgG荧光抗体。
    【操作步骤】
    1.分离白细胞
    （1）标本要求：EDTA-K3抗凝的静脉血2～5ml（白细胞过低患者，如＜200个／mm3，需要采集5～10ml抗凝的静脉血）。分离白细胞必须在标本采集后6～8小时内完成。
    （2）白细胞的分离
    a）加入100μl的试剂A（6%右旋糖酐：血标本体积=1：4），混匀，室温倾斜45°放置（25±5）分钟。将富含白细胞的上清和红细胞顶层移置另一试管中，2000转／分钟离心2分钟，弃去上清液。用蒸馏水或去离子水1: 10稀释试剂B或0. 83%NH4Cl（溶血素），并在2～8℃预冷，取5ml稀释后的试剂B或0.83%NH4Cl，再悬浮沉淀的细胞。
    b）将标本倒入50ml离心管加0.83%NH4C1（溶血素）至50ml，混匀后放入冰箱，10分钟后，2000转／分钟离心2分钟，弃去上清液。
    c）溶血：再悬浮沉淀的细胞混匀后置于2～8℃，10分钟，上述同样条件离心，弃去上清液。如红细胞溶解不完全可重复上述步骤一次。
    （3）洗涤：用5ml的PBS再悬浮沉淀的细胞，上述同样条件离心，洗涤一次。
    2.细胞计数和浓度调整
    （1） 1ml的PBS再悬浮上述沉淀（中性粒细胞＜200个／mm3时，用0. 2mlPBS再悬浮）。
    （2）人工或血细胞计数仪计数粒细胞。
    （3）PBS调整白细胞浓度为3.0×l06／106/ml。
    3.细胞离心涂片
    （1）取125μl上述白细胞悬液至细胞离心涂片机内，1000转／分钟离心3分钟。
    （2）每份标本涂片2张。
    （3）细胞涂片在室温干燥5分钟，也可置于室温过夜。
    4.固定和打孔
    （1）用蒸馏水或去离子水1:5稀释试剂C（固定液）和D（打孔液），用PBS溶液1: 200稀释试剂E（洗液）。
    （2）室温下将2张玻片置于稀释后的试剂C溶液10分钟。
    （3）玻片自试剂C取出用洗液轻轻冲洗一次，然后放入洗液内5分钟。
    （4）室温将玻片置于稀释的试剂D溶液10分钟，玻片自试剂D取出用洗液轻轻冲洗一次，然后放入洗液内5分钟。
    （5）蒸馏水或去离子水轻轻冲洗三次。吹干后立即染色，如置2～8℃可保存24小时。
    5.间接荧光染色
    （1）记号笔在白细胞涂片周围划圈，笔迹干燥后置于PBS溶液内3～5分钟。余后的操作均保持圈内的涂片不干。
    （2）加入试剂F（鼠抗pp65单抗），37℃湿盒内温育30分钟，用0.01mol／L浓度的PBS（pH7.2）冲洗2次，2分钟／次。
    （3）加入试剂G（抗鼠IgG荧光抗体），37℃湿盒内温育30分钟，用0. 01mol/L浓度的PBS（pH7.2）冲洗2次，2分钟／次。蒸馏水冲洗2次。
    （4）封片后荧光显微镜下观察结果。
    6.读片及结果判断
    200×镜下观察10～20个视野，可疑阳性染色400×确定。阳性染色位于白细胞细胞核，呈苹果绿或黄绿色荧光，形态呈圆形或分叶核状。每张片能够找到5个及以上荧光染色的细胞核为阳性。
    【参考范围】
    正常人外周血CMVpp65抗原为阴性。
    【临床意义】
    1.梅毒密螺旋体是梅毒的病原体。梅毒螺旋体可通过性接触和胎盘传播，也可通过输血和伤口传播。血清学是诊断梅毒主要方法。FTA-ABS IgG抗体，与梅毒螺旋体血细胞凝集试验（Treponema pallidum haemagglutination assay， TPHA）和梅毒螺旋体颗粒凝集试验（Treponema pallidum particle agglutina- tion，TP-PA）等一样，系梅毒螺旋体血清学试验方法，用于确认非梅毒螺旋体血清学试验阳性的标本。
    2.CSF-FTA-Ab结果的特异性和敏感性分别为94%和100%，因此FTA-ABS阴性可排除神经性梅毒。
    【标本要求】
    普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存于-20℃保存。脑脊液（CSF）标本不需处理直接保存于2～8℃冰箱，7天内完成检测。
    【方法与原理】
    1.方法 间接免疫荧光法。
    2.原理 固定在生物薄片载片反应区上的梅毒螺旋体涂片与已稀释的标本温育（稀释的血清及CSF预先与非致病的溃蚀密螺旋体混合反应，以除去非特异性交叉反应性抗体吸附）。如果标本中存在抗梅毒螺旋体IgG抗体，则与载片上的梅毒螺旋体抗原结合，当加入荧光素标记的抗人IgG时再与结合后的抗梅毒螺旋体IgG抗体结合，荧光显微镜下可观察到荧光染色的梅毒螺旋体。
    【仪器】
    日本OLYMPUS公司BX51荧光显微镜。
    【试剂】
    德国欧蒙公司产品，试剂盒组成如下：
    1. 10张生物薄片载片。
    2.1. 5ml荧光素标记的羊抗人IgG抗体，直接使用。
    3. 0.1ml抗梅毒密螺旋体抗体阳性对照血清，直接使用。
    4.0.1ml抗梅毒密螺旋体抗体阴性对照血清，直接使用。
    5.2袋磷酸盐，用于配制pH7.2的缓冲液：使用时每袋溶于1L蒸馏水。
    6.2×2ml Tween20 （2ml Tween20加入到1L磷酸盐缓冲液中配成PBS- Tween20缓冲液，用来稀释血清和清洗载片）。
    7. 3.0ml封片介质（磷酸盐缓冲甘油pH8.4）。
    8. 12张盖玻片（62mm×23mm）。
    9.1瓶FTA-ABS吸附剂（冻干品），用5.0ml蒸馏水稀释。
    【操作步骤】
    1.标本吸附 取10μl患者血清标本与40μl已溶解的溃蚀密螺旋体在试管中混合（1:5稀释），CSF标本sotLi与soyi已溶解的溃蚀密螺旋体在试管中混合（1:2稀释），以上标本混合后放置37℃温育30分钟。
    2.标本稀释 温育完毕后在试管中加入配制后的PBS-Tween缓冲液50μl（最终1: 10稀释），CSF标本不再加入PBS-Tween缓冲液（最终1：2稀释）。
    3.加样 将加样板放在泡沫塑料板上，加25μl稀释后标本至加样板每一反应区，避免产生气泡（在所有待检标本加完后再开始温育）。
    4.温育 将生物薄片载片（抗原基质片）盖在加样板的凹槽里，反应开始。确保每一样品均与生物薄片接触且样品间互不接触，室温温育30分钟。
    5.冲洗 用滴管吸取PBS-Tween缓冲液冲洗生物薄片载片两次（倾斜侧面冲洗，勿直接冲洗生物薄片抗原基质区），然后立即将其放入装有PBS-Tween缓冲液的洗缸中至少5分钟，可用旋转摇床进行震荡洗涤。
    6.加样滴加20μl荧光素（FITC）——标记羊抗人IgG抗体（结合物）至一洁净加样板的反应区，加完所有结合物后方可继续温育。荧光素标记羊抗人结合物使用前应混匀。
    7.温育 从PBS-Tween缓冲液中取出一张生物薄片载片，5秒内用纸巾擦一下背面和边缘后，立即盖在加样板的凹槽里，不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基质区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。检查生物薄片是否与结合物液滴接触良好，然后进行下一张载片。结合物温育时间为30分钟，并注意避免光线直射载片。
    8.冲洗 用滴管吸取PBS-Tween缓冲液冲洗生物薄片载片两次（倾斜侧冲洗，勿直接冲洗生物薄片抗原基质区），然后立即将其放入装有PBS-Tween缓冲液的洗缸中至少5分钟（中间换一次缓冲液），可用旋转摇床进行震荡洗涤。
    9.封片 将盖玻片直接放在泡沫塑料板的凹槽里。滴加甘油/PBS至盖玻片：每反应区约20μl，避免封片液过量。从PBS-Tween缓冲液中取出一张生物薄片载片，用纸巾擦干背面和四边，不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基质区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。将生物薄片载片面朝下放在已滴加封片甘油的盖玻片上，立即查看并调整，使盖玻片嵌入载片的凹槽里。然后继续下一张生物薄片载片。封片后的抗原基质片即可在荧光显微镜下观察结果。
    10.结果判断 荧光显微镜下直接观察梅毒螺旋体形态，有无发荧光的螺旋体是判断梅毒螺旋体抗体阳性和阴性的关键。
    （1） FTA-ABS:阳性时在荧光显微镜下可见梅毒螺旋体形态清晰，且呈特异性亮绿色荧光。
    （2） FTA-ABS:弱阳性时在荧光显微镜下可见梅毒螺旋体形态清晰，且呈特异性亮绿色荧光，但荧光亮度较弱。
    （3） FTA-ABS:阴性时则呈非特异性暗绿色荧光，并且梅毒螺旋体形态非常模糊。
    【参考范围】
    1. 1: 10无反应阴 性，未检出IgG型抗梅毒密螺旋体抗体，但不能排除感染的存在。
    2.1: 10有反应且RPR阴性 梅毒感染早期或既往感染。
    3. 1: 10有反应且RPR阳性 可疑梅毒感染，应给予治疗。
80.荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验FTA-ABS IgM
【临床意义】
1.血清标本FTA-ABS IgM阳性提示梅毒近期感染，但需结合其他血清学试验综合判断。
2.新生儿血清FTA-ABS IgM阳性提示先天性梅毒的存在。
【标本要求】
普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存于-20℃保存。脑脊液（CSF）标本不需处理直接保存于2～8℃冰箱，7天内完成检测。
【方法与原理】
1.方法 间接免疫荧光法。
2.原理 固定在生物薄片载片反应区上的梅毒螺旋体涂片与已稀释的血清／CSF标本温育（吸附1：稀释的血清/CSF标本预先与非致病的溃蚀密螺旋体混合反应，以除去非特异性交叉反应性抗体吸附；吸附2：温育后，与溃蚀密螺旋体混合反应后的血清/CSF标本与RF吸附剂反应，以预防可能存在的IgM型类风湿因子与特异性结合的IgG反应导致IgM检测的假阳性，也可避免因特异性的IgG与IgM竞争抗原结合位点导致IgM检测的假阳性，标本中的类风湿因子也可被IgG吸附剂去除。）。如果标本中存在抗梅毒螺旋体IgM抗体，则与载片上的梅毒螺旋体抗原结合，当加入荧光素标记的抗人IgM时再与结合后的抗梅毒螺旋体IgM抗体结合，荧光显微镜下可观察到荧光染色的梅毒螺旋体。
【仪器】
日本OLYMPUS公司BX51荧光显微镜。
【试剂】
德国欧蒙公司产品，试剂盒组成如下：
1. 10张生物薄片载片。
2.1.5ml荧光素标记的羊抗人IgM抗体，直接使用。
3. 0.1ml抗梅毒密螺旋体抗体阳性对照血清，直接使用。
4. 0.1ml抗梅毒密螺旋体抗体阴性对照血清，直接使用。
5.2袋磷酸盐，用于配制pH7.2的缓冲液：使用时每袋溶于1L蒸馏水。
6.2×2ml Tween20（2ml Tween20加入到1L磷酸盐缓冲液中配成PBS-Tween20缓冲液，用来稀释血清和清洗载片）。
7.3.0ml封片介质（磷酸盐缓冲甘油pH8.4）。
8. 12张盖玻片（62mmX 23mm）。
9.1瓶FTA-ABS吸附剂（冻干品），用5.0ml蒸馏水稀释。
10. RF吸附剂（德国欧蒙公司产品，需单独订购）。
【操作步骤】
1.标本吸附 取10μl患者血清标本与40μl已溶解的溃蚀密螺旋体在试管中混合（1:5稀释），CSF标本50μl与50μl已溶解的溃蚀密螺旋体在试管中混合（1：2稀释），以上标本混合后放置37℃温育30分钟。
2.标本稀释 取50μl温育后标本加RF吸附剂50μl（最终1：10稀释，CSF1：4稀释），放置室温1 5分钟后，离心2000转／分钟，5分钟，加样。
3.加样将加样板放在泡沫堑料板上，加25弘l离心后上清至加样板每一反应区，避免产生气泡（在所有待检标本加完后再开始温育）。
4.温育 将生物薄片载片（抗原基质片）盖在加样板的凹槽里，反应开始。确保每一样品均与生物薄片接触且样品间互不接触，室温温育30分钟。
5.冲洗 用滴管吸取PBS-Tween20缓冲液冲洗生物薄片载片两次（倾斜侧面冲洗，勿直接冲洗生物薄片抗原基质区），然后立即将其放入装有PBS-Tween20缓冲液的洗缸中至少5分钟，可用旋转摇床进行震荡洗涤。
6.加样 滴加20μl荧光素（FITC）-标记羊抗人IgM抗体（结合物）至一洁净加样板的反应区，加完所有结合物后方可继续温育。FITC标记羊抗人IgM结合物使用前应混匀。
7.结合物温育 从PBS-Tween20缓冲液中取出一张生物薄片载片，5秒内用纸巾擦一下背面和边缘后，立即盖在加样板的凹槽里，不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基质区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。检查生物薄片是否与结合物液滴接触良好，然后进行下一张载片。结合物温育时间为30分钟，并注意避免光线直射载片。
8.冲洗 用滴管吸取PBS-Tween20缓冲液冲洗生物薄片载片两次（倾斜侧冲洗，勿直接冲洗生物薄片抗原基质区），然后立即将其放入装有PBS-Tween20缓冲液的洗缸中至少5分钟（中间换一次缓冲液），可用旋转摇床进行震荡洗涤。
9.封片 将盖玻片直接放在泡沫塑料板的凹槽里。滴加甘油/PBS至盖玻片：每反应区约20μl，避免封片液过量。从PBS-Tween缓冲液中取出一张生物薄片载片，用纸巾擦干背面和四边，不要擦拭反应区间隙，尤其避免接触到抗原基质区，导致抗原基质组织或细胞形态破坏或被涂掉。将生物薄片载片面朝下放在已滴加封片甘油的盖玻片上，立即查看并调整，使盖玻片嵌入载片的凹槽里。然后继续下一张生物薄片载片。封片后的抗原基质片即可在荧光显微镜下观察结果。
10.结果判断 荧光显微镜下直接观察梅毒螺旋体形态，有无发荧光的螺旋体是判断梅毒螺旋体抗体阳性和阴性的关键。
（1） FTA-ABS:阳性时在荧光显微镜下可见梅毒螺旋体形态清晰，且呈特异性亮绿色荧光。
（2）FTA-ABS:弱阳性时在荧光显微镜下可见梅毒螺旋体形态清晰，且呈特异性亮绿色荧光，但荧光亮度较弱。
（3） FTA-ABS:阴性时则呈非特异性暗绿色荧光，并且梅毒螺旋体形态非常模糊。
【参考范围】
1. 1: 10无反应阴性。未检出IgM型抗梅毒密螺旋体抗体。
2.1: 10有反应梅毒急性感染或处于慢性期，需治疗。
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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验81-90

作者:王泓  日期:2014-06-19

 

    【临床意义】
    1.男性尿道和女性宫颈沙眼衣原体涂片阳性提示沙眼衣原体尿道炎和宫颈炎。
    2.眼结膜涂片沙眼衣原体阳性，提示沙眼衣原体包涵体结膜炎，多见于新生儿。
    【标本要求】
    1.拭子包装为无菌，拭子头材料为藻酸钙（calcium alginate）、涤纶（dacron）、聚酯（polyester）纤维材料制作，柄为塑料或铝质。采集标本时持拭子用力擦下尽可能多的细胞，因为衣原体与细胞相伴随。
    2.男性尿道标本采集 将尿道拭子插入尿道3～4cm，用力旋转数周后拨出。采用滚动压挤方式涂片，目的尽可能将更多上皮细胞涂上。干燥后丙酮或无水乙醇固定10～15分钟。
    3.女性宫颈标本采集 首先用大号拭子擦去宫颈表面黏液，然后用小号拭子插入宫颈内口1cm左右，用力旋转数周后停留20秒，拨出拭子，注意不要将拭子接触阴道壁。涂片及固定与男性尿道拭子涂片相同。
    4.眼结膜涂片 无菌拭子涂擦眼结膜，同样方法涂片和固定。
    【方法与原理】
    1.方法 直接免疫荧光法。
    2.原理 荧光素标记的抗沙眼衣原体单克隆抗体滴加在涂片上，如果标本中存在沙眼衣原体，即与荧光单抗结合，否则被蒸馏水洗去。结合荧光单抗的沙眼衣原体在荧光显微镜下呈荧光染色颗粒。
    【仪器】
    日本Nikon公司Diaphot-200荧光显微镜。
    【试剂】
    芬兰Orion Diagnostica公司产品，荧光素（FITC）标记的抗沙眼衣原体种特异性单克隆抗体（Chlamyset AG）。
    【操作步骤】
    将荧光素（FITC）标记的抗沙眼衣原体种特异性单克隆抗体滴加在标本涂片上（已用丙酮或无水乙醇固定），37℃湿盒内温育30分钟。用蒸馏水泡洗2次，2分钟／次，吹干，封片后在荧光显微镜下观察结果（×200筛察，×400确认）。荧光染色的沙眼衣原体呈圆形针尖大小，染色及亮度均匀，呈苹果绿。每张片能够找到10个及以上荧光染色的沙眼衣原体为阳性。
    【参考范围】
    阴性。
    【临床意义】
    最终阳性结果提示衣原体感染。
    【标本要求】
    1.标本采集
    （1）宫颈标本：用大棉签拭去宫颈口外的分泌物；将另一棉签插入宫颈管内2～3cm；转动棉签2～3圈后取出棉签，勿接触任何阴道壁，放入传送管中；于数标记处拆除棉签杆，盖紧管盖（需使用MicroTrak提供的衣原体EIA专用采样盒）。
    （2）男性尿道标本：将小棉签插入尿道3～4cm，转动2～3圈后取出置于采样管中，于数标记处拆除棉签杆，盖紧管盖（嘱患者采样前1小时内勿小便；若尿道口有分泌物，应先查淋球菌。）（需使用MicroTrak提供的衣原体EIA专用采样盒）。
    （3）男性尿液标本：采集5ml初段尿，不要求晨尿（嘱患者采样前1小时内勿小便；若尿道口有分泌物，应先查淋球菌）。
    （4）结膜标本：用小棉签拭擦睑结膜；将棉签置于试管中，于数标记处拆除棉签杆，盖紧管盖（若两眼需同时采集，先采症状轻一眼）。
    2.标本准备
    （1）宫颈、尿道及眼结膜标本：在标本试管中加入1ml标本处理液。
    （2）男性尿液标本：取4ml尿至聚丙烯试管中，2000×g离心15分钟。在尿沉渣中加入1ml标本处理液。
    （3）摇匀阳性质控（60秒）、阴性质控，立即吸取100μl至相应标记试管（含1ml标本处理液）中。
    （4）将标本及质控置于已预热板（95～100℃）上15分钟，之后置于管架冷却10分钟。挤尽液体后弃去棉签。
    注意：若采集的标本当天不能安排检测，则在放置标本的试管中加入1ml标本处理液后，放置2～8℃可储存1～2周。务必在使用前平衡到室温后才能进行加热处理。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay， ELISA）。
    2.原理 将兔抗衣原体脂多糖（LPS）抗体加入微孔中，然后加入处理后的标本并孵育，若存在衣原体抗原，则与抗体形成Ag-Ab复合物，并黏附在微孔上，未结合的物质被冲洗掉。在微孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，其与微孔上黏附的兔抗体结合，冲洗除去为结合物质。加入底物与酶反应，使微孔呈蓝色，最后加入的终止液使微孔呈黄色。分光光度计在450nm参考波长为630nm下检测得到吸光值。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    Trinity公司，试剂盒组成如下：

成分
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个微孔（不可拆分），直接使用
2.标本处理液（红色）
直接使用
3.抗体试剂（蓝色）（含兔抗LPSIgG）
直接使用
4.阳性质控
需稀释
5.阴性质控
需稀释
6.酶结合物
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔
IgG抗体，直接使用
7.浓缩冲洗液（绿色）
通用试剂，20倍稀释
8.底物A（含尿素一过氧化氢）
通用试剂，直接使用
9.底物B（含四甲二砷）
通用试剂，直接使用
10.终止液（含1NH2SO4）
通用试剂，直接使用
12×8
 
 
1×100ml
 
1×14ml
 
1×1.0ml
 
1×1.0ml
 
1×14ml
 
 
1×100ml
 
1×15.5ml
 
1×15.5ml
 
1×26ml
Microwellassaystrips
 
 
Specimentreatmentsolution
 
Antibodyreagent
 
Positivecontrol
 
Negativecontrol
 
Enzyme-antibodyconjugate
 
 
Washconcentration
 
SubstrateA
 
SubstrateB
 
Stopsolution

    【操作步骤】
    1.实验前处理
    （1）实验前将未打开的封口袋、实验组分和标本等平衡至室温（21～25℃）。摇匀。
    （2）将浓缩冲洗液（100ml）用去离子化水／或蒸馏水稀释为2L冲洗液，摇匀。浓缩冲洗液。
    2.检测过程
    （1）取出需要数量的微孔条，做标记，每板设3个阴性质控孔、1个阳性质控孔。
    （2）在所有微孔中加入100μl抗体剂；在标本孔中加入100μl患者标本；在质控孔中分别加入100μl质控剂。
    （3）将微孔板置于（37±2）℃孵育（90±5）分钟。
    （4）冲洗所有微孔5次（每孔注入300）μl冲洗液，每次浸泡10秒）。
    （5）将微孔条倒置在吸水纸上，拍干。
    （6）在所有微孔中加入100μl结合物。
    （7）轻拍摇匀微孔条，（37±2）℃孵育（30±5）分钟。
    （8）重复第4（冲洗）、5（拍干）步骤。
    （9）在所有微孔中加入100μl底物（先加入50μl底物B，再加入50μl底物A；或者将底物A和B等量配好后加入）。
    （10）振荡摇匀微孔条。（37±2）℃孵育（30±2）分钟。
    （11）在所有微孔中加入100μl终止液，轻拍摇匀微孔条。5分钟后，1小时内读取吸光值。
    （12）用酶标仪（450nm波长）检测各孔吸光值（若用双波长光，应设置在600～650nm）。酶标仪以空气调零，阅读整板吸光值（O.D）。
    （13）结果计算
    a）计算阴性质控平均值及临界值（平均阴性质控值+0.20）：
    例如：各阴性质控值=0.128，0.083，0.065
    平均阴性质控值=（0.128+0. 083+0. 065）／3=0. 092
    临界值（cut-off） =0. 092+0. 20=0. 292
    b）若某一阴性质控值与平均值之差＞0. 050，则应以另两个值计算；阴性质控平均值应＜0. 200；阳性质控与阴性质控之差应＞0. 800。
    【参考范围】

标本吸光值
结果
解释
＜临界值×75%
临界值×75%～临界值×125%
＞临界值×125%
阴性
灰区
阳性
未检到衣原体抗原
不确定
检测到衣原体抗原

    【临床意义】
    大多数EB病毒感染为隐性感染。EB病毒感染后，几乎所有患者血清中可检出抗EB病毒抗体。通常情况下，抗体可携带终生。成人EB病毒的感染率为80%。当机体的免疫防御功能减弱时，既往感染的EB病毒可再次激活。
    本试验为定性试验，临床意义较为局限，即双份标本存在抗EB病毒IgG抗体阳转时，则实验室诊断EBV原发性感染。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）。
    2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被EB抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗EB病毒抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的EB病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgG类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgG抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗EB病毒抗原抗体浓度成正比。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    欧蒙公司，试剂盒组成如下：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品1
200RU/ml（IgG，人），直接使用
3.标准品2
20RU／ml（IgG，人），直接使用
4.标准品3
2RU/rnl（IgG，人），直接使用
5.阳性对照
（IgG，人），直接使用
6.阴性对照
（IgG，人），直接使用
—
 
 
深红
 
红色
 
浅红
 
蓝色
 
绿色
12×8
 
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
Strips
 
 
CAL1
 
CAL2
 
CAL3
 
Poscontrol
 
Negcontrol

    续表

成分
颜色
规格
代码
7.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgG（兔），直接
使用
8.标本缓冲液
直接使用
9.清洗缓冲液
10倍浓缩
10.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
11.终止液
0.5mol／L硫酸，直接使用
绿色
 
 
浅蓝
 
无色
 
无色
 
无色
1×12ml
 
 
1×100ml
 
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
Conjugate
 
 
Samplebuffer
 
Washbuffer10×
 
Substrate
 
Stopsolution

    【操作步骤】
    1.标本稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1: 10稀释。
    2.加样按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
    3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
    5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgG）至每一微孔。
    6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    7.清洗 重复4步骤清洗。
    8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
    9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
    10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
    11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
    12.结果判定 可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品2吸光度的比值，半定量计算结果：
   
    出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
    【参考范围】
    标本的吸光度与标准品吸光度比值小于0.8为抗EB病毒IgG抗体阴性，大于1.1是阳性；比值在0.8到1.1之间为灰区，建议再取一份患者标本做重复实验。
    【临床意义】
    阳性提示EB病毒近期感染。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay， ELISA）。
    2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被EB病毒抗原成分的酶免疫反应板上，首先用含有欧蒙IgG/RF吸附剂的缓冲液稀释标本，去除标本中的IgG和RF.以检测特异性IgM。在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗EB病毒抗原成分的抗体，则可以特异性地和酶免疫反应板上的EB病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗EB病毒抗原抗体浓度成正比，可根据试剂盒中标准血清测定结果半定量计算出患者标本中抗EB病毒抗原抗体浓度。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    欧蒙公司，试剂盒组成如下：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（lgM，人），直接使用
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接
使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0.5mol／L硫酸，直接使用
—
 
 
浅红
 
蓝色
 
绿色
 
绿色
 
 
浅蓝
 
无色
 
无色
 
无色
12×8
 
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×12ml
 
 
1×100ml
 
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
Strips
 
 
CAL3
 
Poscontrol
 
Negcontrol
 
Conjugate
 
 
Samplebuffer
 
Washbuffer10×
 
Substrate
 
Stopsolution

    【操作步骤】
    1.标本稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本。如，可取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀），室温静置30分钟。
    2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
    3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
    5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
    6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    7.清洗 同第4步骤清洗。
    8.底物温育  滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
    9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
    10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
    11.比色 450nm比色波长，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
    12.结果判定
    半定量：按以下公式计算对照血清或患者标本吸光度与标准品吸光度的比值。
    半定量估计结果：比值=对照血清或患者标本的吸光度值／标准品的吸光度值。
    【参考范围】
    比值＜0.8，判断为阴性。
    比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
    比值≥1.1，判断为阳性。
    【临床意义】
    EBV-CA-IgA对鼻咽癌诊断具有较高敏感性，可作为鼻咽癌高危人群临床筛查的重要指标。并且其滴度随着病情的进展和肿瘤转移范围的扩大而增加，经过放疗后病情好转患者血清EBV-CA-IgA滴度下降，而肿瘤复发时EBV-CA-IgA滴度再次上升，因此EBV-CA-IgA可作为鼻咽癌的诊断、治疗及预后判断的指标。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay，ELISA）。
    2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被EB抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗EB病毒抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的EB病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgA类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgA抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗EB病毒抗原抗体浓度成正比。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    欧蒙公司，试剂盒组成如下：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgA，人），直接使用
3.阳性对照
（IgA，人），直接使用
4.阴性对照
（IgA，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgA（兔），直接
使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液0.5mol/L硫酸，直接使用
—
 
 
浅红
 
蓝色
 
绿色
 
绿色
 
 
浅蓝
 
无色
 
无色
 
无色
12×8
 
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×12ml
 
 
1×100ml
 
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
Strips
 
 
CAL3
 
Poscontrol
 
Negcontrol
 
Conjugate
 
 
Samplebuffer
 
Washbuffer10×
 
Substrate
 
Stopsolution

    【操作步骤】
    1.标本稀释 用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1: 10稀释。
    2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
    3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
    5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgA）至每一微孔。
    6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    7.清洗 重复4步骤清洗。
    8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
    9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
    10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。比色：450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
    11.结果判定 可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品吸光度的比值，半定量计算结果：
   
    出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
    【参考范围】
    1.比值＜0.8，判断为阴性。
    2.比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
    3.比值≥1.1，判断为阳性。
    【临床意义】
    EBV- EA-IgA抗体只在疾病的急性期短暂出现，但该抗体在传染性单核细胞增多症中的阳性发生率为70%～80%。高滴度的EBV-EA-IgA提示慢性感染或感染后复发。此外，抗EBV-EA-IgA抗体与伯基淋巴瘤和鼻咽癌也有关。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay， ELISA）。
    2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被EB抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗EB病毒抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的EB病毒抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgA类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgA抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗EB病毒抗原抗体浓度成正比。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    欧蒙公司，试剂盒组成如下：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU/ml（IgA，人），直接使用
3.阳性对照
（IgA，人），直接使用
4.阴性对照
（IgA，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgA（兔），直接
使用
6.标本缓冲液
直接使用
—
 
 
浅红
 
蓝色
 
绿色
 
绿色
 
 
浅蓝
12×8
 
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×12ml
 
 
1×100ml
Strips
 
 
CAL3
 
Poscontrol
 
Negcontrol
 
Conjugate
 
 
Samplebuffer

    续表

成分
颜色
规格
代码
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液
0.5moI／L硫酸，直接使用
无色
 
无色
 
无色
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
Washbuffer10×
 
Substrate
 
Stopsolution

    【操作步骤】
    1.标本稀释 用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1：10稀释。
    2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
   3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
    5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgA）至每一微孔。
    6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    7.清洗 重复4步骤清洗。
    8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
    9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
    10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
    11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
    12.结果判定可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品吸光度的比值，半定量计算结果。
   
    出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
    【参考范围】
    1.比值＜0.8，判断为阴性。
    2.比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
    3.比值≥1.1，判断为阳性。
    【临床意义】
    猪囊虫感染（囊虫病）的辅助实验室诊断。
    【标本要求】
    1.普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
    2.避免使用溶血、浑浊或脂血标本及反复冻融标本。
    【方法与原理】
    1.方法间接酶联免疫吸附法。
    2.原理微孔条预包被纯化抗原与血清中囊虫抗体反应，加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与之结合，辣根过氧化物酶催化底物显色。
    【仪器】
    1.酶标仪。
    2. 37℃恒温水箱。
    3.微量振荡器。
    【试剂】
    深圳博卡生物技术有限公司产品。
    1.进口抗原预包被反应条，12×4条。
    2.酶结合物（抗人IgG酶标抗体），1支×6ml。
    3.浓缩洗液（20倍），1支×10ml。
    4.样本稀释液，1支×25ml。
    5.阴、阳性对照品，各1支。
    6.显色剂A、显色剂B，各1支。
    7.终止液，1支。
    8.说明书，1份。
    【操作步骤】
    1.配制洗涤液 1支浓缩洗涤液20倍稀释。
    2.样本稀释 待测血清用样本稀释液1: 50稀释（490μl稀释液加10μl血清，脑脊液不稀释），建议样本稀释液每人份每次不超过500μl用量。
    3.加样 加入已稀释的标本，每孔100μl，并设空白、阴性、阳性对照个一孔。阴性、阳性对照各加每孔100μl（直接用，不稀释），空白对照（加样本稀释液），置37℃温育30分钟。
    4.洗板 用洗板机洗涤微孔板条3～5次，每次浸泡20秒左右。
    5.加酶结合物 每孔加酶结合物2滴，置37℃温育30分钟。
    6.洗板 用洗板机洗涤微孔板条3～5次，每次浸泡20秒左右。
    7.显色 每孔加显色剂A、显色剂B各一滴（或50μl）混匀，37℃10分钟。
    8.将所有微孔中加入1滴（或50μl）终止液，轻拍摇匀微孔条。
    9.用酶标仪（450nm波长）检测各孔吸光度。
    10.结果计算
    （1）临界值（C.O.）=阴性对照OD值×2.1（阴性对照OD值＜0.1以0.1计）。
    （2）阳性：样本OD值S/C.O.≥1（S/CN≥2.1）。
    （3）阴性：样本OD值S/C.O.＜1（S／CN＜2.1）。
    在临界值附近的样品，应重复检测，并结合临床症状综合判断。
    【参考范围】
    阴性。
    【临床意义】
    用于甲型流感病毒感染的辅助诊断。
    【标本要求】
    采集样本的无菌拭子推荐使用聚丙烯（PP）杆的聚酯海绵拭子。
    1.鼻腔分泌物采集 收集鼻腔分泌物时，将拭子插入鼻腔中分泌物最多处，轻轻转动并向鼻腔内部推动拭子，直至鼻甲（离鼻孔约2. 0～2. 5cm）受阻处，贴鼻腔壁旋转拭子三次，取出拭子。
    2.咽喉分泌物采集 将拭子从口腔完全插入咽喉肿，以咽喉壁、上颚扁桃的发红部位为中心，适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部，取出拭子。
    3.标本采集后应尽快采用病毒采样液或本试剂盒提供的样本提取液进行处理。如不能立即处理，标本应立即置于干燥、消毒并严格密封的塑料管内储存，2～8℃下可保存8小时，-70℃可长期保存。
    【方法与原理】
    1.方法 胶体金法。
    2.原理 本品利用免疫层析技术，采用双抗体夹心法检测A型流感病毒抗原。检测时，将处理后的待测样品滴加于测试卡的加样孔，当待测样本中含有A型流感病毒抗原且抗原浓度高于最低检出量时，A型流感病毒抗原先和标记抗体形成反应复合物，在层析作用下，反应复合物沿着硝酸纤维膜向前移动，被硝酸纤维膜上检测区（T）预先包被的流感A核蛋白单克隆抗体捕获，在检测区上最终形成一条红色／粉色反应线，此时结果为阳性；相反，当待测样本中不含A型流感病毒抗原或抗原浓度低于最低检出量时，则检测区无红色／粉色反应线出现，此时结果为阴性。无论样本是否含有A型流感病毒抗原，质控区（C）都会形成一条红色／粉色反应线，质控区（C）内所显现的红色／粉色反应线是判定层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
    【试剂】
    试剂盒由测试卡、样本提取液、样本提取管、滴头、使用说明书和合格证组成。
    1.测试卡由硝酸纤维膜、玻璃纤维、滤纸、PVC板、塑料盒等其他支持物组成，硝酸纤维膜包被有流感A核蛋白单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体。
    2.样本提取液主要为磷酸盐缓冲液（PBS） （0.1mol／L，pH7.2±0.2）。
    【操作步骤】
    测试前将所有试剂恢复至室温，测试应在室温下进行。
    1.样本提取
    （1）在样本提取内垂直加入400μl（约10滴）样本提取液。
    （2）将采样后的拭子插入样本提取管中溶液内，仅靠管壁内旋约10次，使标本尽可能溶解在溶液中。
    （3）沿提取管内壁挤压拭子的签头，使液体尽可能的留在管内，取出并弃去拭子。
    （4）盖上滴头。
    2.检测程序
    （1）沿铝箔袋撕口打开，将测试卡取出，平放。
    （2）向测试卡的加样孔中滴加入80μl（约3～4滴）处理后的样本提取物或直接加入80μl处理后的病毒采样液。
    （3）15～20分钟内观察显示结果，在30分钟后显示的结果无临床意义。
    3.检验结果的解释
    （1）阳性：两条红色／粉色反应线，即在检测区（T）及质控区（C）各出现一条红色／粉色反应线。
    （2）阴性：一条红色／粉色反应线，即仅在质控区（C）出现一条红色／粉色反应线。
    （3）无效：质控区（C）无红色／粉色反应线出现，检测无效，建议此时用新测试卡重新检测。
    反应线显色深浅与提取样本中所含的被检测物质含量有关，无论颜色强度多少，都应按照反应线是否显色判定结果。
    【临床意义】
    最终阳性结果提示嗜肺军团菌近期感染或既往感染。
    【标本要求】   1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
    2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）。
    2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被嗜肺军团菌抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗嗜肺军团菌抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的嗜肺军团菌抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgG类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgG抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗嗜肺军团菌抗原抗体浓度成正比。
    【仪器】
    瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
    【试剂】
    欧蒙试剂盒内试剂组成：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品1
200RU/ml（IgG，人），直接使用
3.标准品2
20RU/ml（IgG，人），直接使用
—
 
 
深红
 
红色
12×8
 
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
Strips
 
 
CAL1
 
CAL2

    续表

成分
颜色
规格
代码
4.标准品3
2RU/ml（IgG，人），直接使用
5.阳性对照
（IgG，人），直接使用
6.阴性对照
（IgG，人），直接使用
7.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgG（兔），直接
使用
8.标本缓冲液
直接使用
9.清洗缓冲液
10倍浓缩
10.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
11.终止液
0.5mol／L硫酸，直接使用
浅红
 
蓝色
 
绿色
 
绿色
 
 
浅蓝
 
无色
 
无色
 
无色
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×12ml
 
 
1×100ml
 
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
CAL3
 
Poscontrol
 
Negcontrol
 
Conjugate
 
 
Sample
buffer
Wash
buffer10×
Substrate
 
Stopsolution

    【操作步骤】
   1.标本 稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1: 10稀释。
    2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
    3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
    5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgG）至每一微孔。
    6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
    7.清洗 重复4步骤清洗。
    8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
    9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
    10.终止反应  以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
    11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
    12.结果判定 可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品吸光度的比值，半定量计算结果：
   
    【参考范围】
    1.比值＜0.8，判断为阴性。
    2.比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
   3.比值≥1.1，判断为阳性。
    出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
90.抗嗜肺军团菌抗体IgM检测
【临床意义】
最终阳性结果提示嗜肺军团菌近期感染。
【标本要求】
1.普通管静脉血标本1～2ml，常规分离血清。如果7天内完成检测，血清置2～8℃保存，否则冻存-20℃保存。脑脊液（CSF）标本2～8℃保存。
2.不合格标本处置 如送检标本系抗凝血、严重脂血、严重溶血标本或空管，应立即与送检病房或门、急诊治疗室电话联系，重新留取合格标本送检。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay， ELISA）。
2.原理 稀释后的待检血清滴加在包被嗜肺军团菌抗原成分的酶免疫反应板上，在第一次温育时，稀释后的标本在微孔中反应。如果被检血清中存在抗嗜肺军团菌抗原成分的抗体，则特异性地与酶免疫反应板上的嗜肺军团菌抗原成分结合形成抗原抗体复合物（IgM类），再与加入的过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白IgM抗体结合，与加入的底物发生颜色反应。颜色的深浅与抗嗜肺军团菌抗原抗体浓度成正比。
【仪器】
瑞士TECAN公司的SUNRISE酶标仪和美国Etllisted公司MultiWash Plus型洗板机。
【试剂】
欧蒙试剂盒内试剂组成：

成分
颜色
规格
代码
1.微孔板
包被有抗原的微孔：12条，每条有8个可
拆分的微孔，直接使用
2.标准品
2RU／ml（IgM，人），直接使用
3.阳性对照
（IgM，人），直接使用
4.阴性对照
（IgM，人），直接使用
5.酶结合物
过氧化物酶标记的抗人IgM（兔），直接
使用
6.标本缓冲液
直接使用
7.清洗缓冲液
10倍浓缩
8.色原／底物液
TMB/H2O2，直接使用
9.终止液
0.5mol／L硫酸，直接使用
—
 
 
浅红
 
蓝色
 
绿色
 
绿色
 
 
浅蓝
 
无色
 
无色
 
无色
12×8
 
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×2.0ml
 
1×12ml
 
 
1×100ml
 
1×100ml
 
1×12ml
 
1×12ml
Strips
 
 
CAL3
 
Poscontrol
 
Negcontrol
 
Conjugate
 
 
Sample
buffer
Washbuffer10×
 
Substrate
 
Stopsolution

【操作步骤】
1.标本 稀释用标本缓冲液1：101稀释待测血清或血浆标本，如取10μl血清用1.0ml标本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀（不适合用加样枪混匀）。CSF标本1: 10稀释。
2.加样 按加样方案向相应微孔分别滴加标准品、阳性对照、阴性对照或稀释后的患者标本各100μl。
3.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
4.清洗 用稀释后的清洗缓冲液洗3次，每次300μl。每次清洗时缓冲液在微孔中至少保留30～60秒。清洗后（包括人工或自动）应将微孔板倒置在吸水纸上甩打，以去除残存的清洗液。注意：清洗后遗留在微孔中的残液（＞10μl）可干扰底物反应而导致低吸光度值偏低。清洗不充分（如清洗少于3次、清洗液太少或清洗时间太短）可能导致吸光度值偏高。
5.酶结合物温育 滴加100μl酶结合物（过氧化物酶标记的抗人IgM）至每一微孔。
6.温育 室温（18～25℃）温育30分钟。
7.清洗 重复4步骤清洗。
8.底物温育 滴加100μl色原／底物液至每一微孔。
9.温育 室温（18～25℃）避光温育15分钟。
10.终止反应 以与加色原／底物液时相同的速度和顺序滴加100μl终止液至每一微孔。
11.比色 450nm比色，参考波长介于620～650nm之间，加完终止液后30分钟之内比色，比色前，轻轻摇动微孔板以使液体扩散均匀。
12.结果判定 可通过以下公式计算对照血清或标本吸光度与标准品吸光度的比值，半定量计算结果：
 
【参考范围】
1.比值＜0.8，判断为阴性。
2.比值≥0.8至＜1.1，判断为可疑，建议复查。
3.比值≥1.1，判断为阳性。
出现可疑结果时，应于7日后再次采集标本，并与上次采集的标本同时检测，以进行比较。
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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验91-100

作者:王泓  日期:2014-06-19

 

    【临床意义】
    柯萨奇病毒和埃柯病毒是无菌性脑膜炎的主要病原。柯萨奇病毒A组9型可引起无菌性脑膜炎瘫痪、皮疹、婴儿肺炎及肝炎等。柯萨奇病毒Bl至B6可引起胸膜痛、无菌性脑膜炎、心包炎、心肌炎等。
    埃柯病毒可引起无菌性脑膜炎、瘫痪、脑炎、共济失调、格林巴利综合征、呼吸道疾病等。另外埃柯病毒还可引起腹泻、流行性肌痛、心包炎、心肌炎、肝疾病等。
    肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型主要与手足口病有关。手足口病一种常见的皮肤病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，急性起病，发热；口腔黏膜出现散在疱疹，米粒大小，疼痛明显；手掌或脚掌部出现米粒大小疱疹，臀部或膝盖偶可受累。疱疹周围有炎性红晕，疱内液体较少。部分患儿可伴有咳嗽、流涕、食欲缺乏、恶心、呕吐、头疼等症状。该病为自限性疾病，多数预后良好，不留后遗症。极少数患儿可引起脑膜炎、脑炎、心肌炎、弛缓性麻痹、肺水肿等严重并发症。
    【标本要求】
    本检验项目涉及肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）、柯萨奇病毒A组16型（Coxsackie A16，CoxA16）、柯萨奇病毒B组（CoxB）及埃柯病毒（Echo）的培养及鉴定。
    标本以疱疹液、咽拭子和脑脊液为主。疱疹液标本采集方法有三种：①酒精消毒水疱表面后使用注射器抽取疱疹液，然后将抽取的疱疹液注入（涮洗入）3ml含抗生素及保护蛋白的运输液（viral transport medium，VTM）中；②酒精消毒水疱表面后用注射器针头刺破水疱，无菌拭子（意大利Copan公司产品，塑料粗杆拭子，这样可尽量多吸去标本）蘸取水疱液；③已经溃破的疱疹皮损可用无菌拭子擦吸基地部或溃疡面的疱疹液及感染细胞。咽拭子采集使用无菌拭子（意大利Copan公司产品，塑料粗杆拭子，这样可尽量多吸去标本）擦取患者的咽颊部标本。CSF标本由临床医生常规采集，标本量介于0.1～1ml均可，注射器滴（注射）入3ml的VTM中，同样在管上记录患者的ID。
    3ml的VTM倒入拭子管内，采样后的拭子标本立即放置其中，在管上记录患者的ID。所有采集后并置于VTM的标本应立即送至检验科病毒室，如不能，应将标本放置在2～8℃冷藏（请勿冷冻）保存，24小时内应送至病毒室。拭子管标本在运输过程中不可倒置，以免标本遗洒。
    【方法与原理】
    离心细胞培养技术（shell vial culture，SVC）及荧光标记的单克隆抗体直接染色法（direct fluorescent antibody，DFA）。通过物理离心力作用将标本中的可疑病毒颗粒（附着在细胞或碎片中）压挤附着在培养细胞上，从而大大提高病毒培养的敏感性，并缩短培养时间。通过荧光标记的单克隆抗体染色病毒增殖后的感染细胞，在免疫学及形态学两方面对其快速鉴定。
    【操作步骤】
    1.细胞培养
    （1）基本设备：美国Baker公司的A/B3生物安全柜（用于细胞和病毒培养）、Nikon公司TMS倒置显微镜、美国BECKMAN J6-MC离心机及配套的细胞培养板架。Olympus公司的X71倒置荧光显微镜和德国Heidolph公司 Paromax 2020型洗涤摇床等。
    （2）细胞株：人胚肺成纤维细胞（MRC-5）和人喉癌细胞（HEp-2）。细胞培养液为10%胎牛血清（美国HyClone公司）Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM，Sigma公司）培养基，含50μg/ml庆大霉素（Sigma公司）。
    （3）细胞传代及12孔板内单层细胞的设置：细胞传代为每周一和周五进行，具体为周1传代设置周3～5使用的细胞，周5传代设置下周1～2使用的细胞。
    （4）75cm2的培养瓶（美国Corning-Costar公司）内的MRC-5和HEp-2细胞生长成为单层细胞后，无菌0. 01mol／L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入2ml消化液（0.05%胰酶和0. 02%EDTA钠盐混合溶液），快速均匀覆盖细胞面后倾去多余的消化液，37℃温箱内消化10分钟，用10ml细胞生长液吹下细胞，并吹打数次再悬浮，取：
    a）周1传代设置
    MRC-5细胞
    ◆2ml细胞悬液+10ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留1ml+19ml细胞培养液（继续传代使用）
    b）周5传代设置
    MRC-5细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10.5ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留3ml+17ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    与细胞培养液混合后的稀释的细胞悬液按照每孔2ml的量种植于12孔细胞培养板内，MRC-5细胞种植在12孔板的第1和第3列（共计6孔），HEp-2细胞种植在12孔板的第2和第4列（共计6孔）。种植细胞的12孔板置于湿盒内并37℃温箱和5 %CO2培养。
    2.病毒培养
    （1）临床送达的病毒培养标本，如果24小时内能够接种，则放置2～8℃保存，否则冻存于-80℃冰箱内。
    （2）新鲜标本或自-80℃冰箱化冻的标本，接种前握拭子柄对标本管壁反复挤压拭子头，以便更多的可疑病毒标本挤入VTM，弃去拭子于消毒液内。如果为无拭子标本，仅将标本（VTM）混匀接种即可。
    （3）在12板标记需要接种的标本编号，用无菌塑料吸管吸去待接种孔内的细胞培养液，按照0. 5ml（VTM）／孔接种标本，每次接种设置阴性对照。每次更换培养液和（或）复苏新的细胞株时进行阳性质控，使用柯萨奇病毒B组（CoxB）阳性毒株（CAP室间质评标本，VRl-07，2009），阳性质控株单美国独接种一块12孔细胞培养板，不与临床标本接种同一块细胞培养板，以避免可能污染临床标本结果。
    （4）接种标本后的12孔细胞培养板进行离心培养，使用美国BECKMAN公司的J6-MC离心机，2000转／分钟，35℃离心60分钟。离心后的12孔细胞培养板置于35.5℃和5%CO2温箱吸附1小时，然后吸去接种物，加入病毒培养液（1%FBS DMEM培养基，含万古霉素50μlml，庆大霉素50μg／ml和二性霉素B 2.5μg／ml），病毒培养液加入量为每孔1.5～2ml，12孔细胞。
    （5）最终置于35.5℃和5% CO2温箱培养，每日观察细胞病变效应（cyto-pathic effect，CPE）。接种后3～4天更换病毒培养液1次。
    3.病毒培养鉴定
    （1）当病毒在培养细胞中生长时，可出现明显的CPE，表现为细胞肿胀变圆，折光性增强，有些呈葡萄串样改变，最终可见感染细胞死亡脱落。
    （2）一旦细胞出现明显的CPE应立即保存阳性培养物，并进行鉴定，使用间接荧光法（IFA）。保存阳性培养物：将CPE孔内的病毒培养液吸出后加入含1滴20% BSA溶液的2ml无菌管内并- 80℃冰箱保存。IFA鉴定：无菌0. 01mol／L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入3滴消化液，37℃消化10分钟，2ml细胞生长液再悬浮消化后的细胞并吸回至试管内，塑料吸管在试管内反复吹打数次，PBS洗涤2次（1000转／分钟离心3分钟）。最终0.5ml的PBS再悬浮，滴10孔玻片一张，保留剩余可疑感染细胞悬液备用。滴片后的玻片在生物安全柜内吹干，冷丙酮固定15分钟，取出后晾干。分别滴加抗肠道病毒单克隆抗体，滴加量约每孔10μi，均为美国LIGHT DIAGNOSTICSrM Chemicon Inter- national公司产品，现为Millipore公司。
    1）肠道病毒71型（Enterovirus 71）／柯萨奇病毒A组16型（CoxsackievirusA16）混合单克隆抗体。
    2）肠道病毒71型（Enterovirus 71）单克隆抗体。
    3）柯萨奇病毒B组（Coxsackievirus，CoxB）混合型单抗，涵盖柯萨奇病毒B组1、2、3、4、5和6型。
    4）埃柯病毒（Echovirus，Echo）混合型单克隆抗体，涵盖埃克病毒4、6、9、11、30和34型。
    5）泛肠道病毒单克隆抗体（Pan-Enterovirus），涵盖除上述病毒外，还包括脊髓灰质炎病毒1～3型、肠道病毒70型和柯萨奇病毒A组9型。
    （3）37℃湿盒内温育30分钟，PBS洗片2次，DW漂洗1次。晾干后滴加工作浓度的荧光标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，再次37℃湿盒内温育30分钟，PBS洗片2次，DW漂洗1次。晾干后封片甘油封片。荧光显微镜下观察结果。
   （4）接种后10天仍然未出现CPE的接种孔，仍然使用泛肠道病毒单克隆抗体（Pan-Enterovirus）IFA方法进行染色抗原检测，以防止极少数情况下有病毒培养生长，但产生的CPE不明显。操作方法同于出现CPE病变的培养孔。
    【参考范围】
    正常人群肠道病毒培养阴性。
    【临床意义】
    疱疹病毒皮损临床表现存在部位的差异，但单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和单纯疱疹病毒2型（HSV-2）在口唇和生殖器部位的感染存在的交叉，即约15%的生殖器疱疹由HSV-1所致，而少数口唇疱疹也可由HSV-2感染所致。上述任何疱疹病毒培养阳性均应考虑为致病病原体。
    【标本要求】
    本检验项目涉及巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）和带状疱疹-水痘病毒（VZV）的培养及鉴定。
    HSV及VZV标本以疱疹液（拭子）为主，如眼角膜、齿龈及咽颊部、口唇部、胸腰部和生殖会阴部等，其他标本的采集还有脑脊液标本（CSF）。疱疹液标本采集方法有三种，①一是酒精消毒水疱表面后使用注射器抽取疱疹液，然后将抽取的疱疹液注入（涮洗入）3ml含抗生素及保护蛋白的运输液（viral transport medium，VTM）中；②酒精消毒水疱表面后用注射器针头刺破水疱，无菌拭子（意大利Copan公司产品，塑料粗杆拭子，这样可尽量多吸去标本）蘸取水疱液；③已经溃破的疱疹皮损可用无菌拭子擦吸基地部或溃疡面的疱疹液及感染细胞。
    CMV培养标本包括尿标本、呼吸道标本（参见呼吸道病毒培养和鉴定章节）、支气管和肺泡灌洗液（BAL）及外周血单个核细胞（PBMC）。尿标本，为清洁中段尿标本，由于CMV经尿液排除是间断性过程，因此，多份尿标本可增加阳性检测率；呼吸道标本，以鼻拭子为主；PBMC尤其适用于免疫抑制患者，因为病毒室已开展敏感性和特异性良好的CMV pp65抗原血症检测项目，故该标本不作为主要选择。
    将3ml的VTM倒入拭子管内，采样后的拭子标本立即放置其中，在管上记录患者的ID。尿液标本1～2ml，滴加入含3ml的VTM管内，在管上记录患者的ID。CSF标本和BAL标本由临床医生常规采集，标本量介于0.1～1ml均可，注射器滴（注射）入3ml的VTM中，同样在管上记录患者的ID。
    所有采集后并置于VTM的标本应立即送至检验科病毒室，如不能，应将标本放置在2～8℃冷藏（请勿冷冻）保存，24小时内应送至病毒室。拭子管标本在运输过程中不可倒置，以免标本遗洒。
    【方法与原理】
    离心细胞培养技术（shell vial culture，SVC）和荧光标记的单克隆抗体直接染色法（direct fluorescent antibody，DFA）。通过物理离心力作用将标本中的可疑病毒颗粒（附着在细胞或碎片中）压挤附着在培养细胞上，从而大大提高病毒培养的敏感性，并缩短培养时间。通过荧光标记的单克隆抗体染色病毒增殖后的感染细胞，在免疫学及形态学两方面对其快速鉴定。
    【操作步骤】
    1.细胞培养
    （1）基本设备：美国Baker公司的A/B3生物安全柜（用于细胞和病毒培养）、Nikon公司TMS倒置显微镜、美国BECKMAN J6-MC离心机及配套的细胞培养板架。Olympus公司的X71倒置荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax 2020型洗涤摇床等。
    （2）细胞株：人胚肺成纤维细胞（MRC-5）和人喉癌细胞（HEp-2）。细胞培养液为10%胎牛血清（美国HyClone公司）Dulbecco's Modified Eagle Medium（D-MEM，Sigma公司）培养基，含50μg／ml庆大霉素（Sigma公司）。
    （3）细胞传代及12孔板内单层细胞的设置：细胞传代为每周一和周五进行，具体为周1传代设置周3～5使用的细胞，周5传代设置下周1～2使用的细胞。
    （4） 75cm2的培养瓶（美国Corning-Costar公司）内的MRC-5和HEp-2细胞生长成为单层细胞后，无菌0. 01mol／l。PBS.pH7.4洗涤细胞面2次，加入2ml消化液（0. 05%胰酶和0.02%EDTA钠盐混合溶液），快速均匀覆盖细胞面后倾去多余的消化液，37℃温箱内消化10分钟，用10ml细胞生长液吹下细胞，并吹打数次再悬浮，取：
    1）周1传代设置
    MRC-5细胞
    ◆2ml细胞悬液+10ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留1ml+19ml细胞培养液（继续传代使用）
    2）周5传代设置
    MRC-5细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留3ml+17ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    （5）与细胞培养液混合后的稀释的细胞悬液按照每孔2ml的量种植于12孔细胞培养板内，MRC-5细胞种植在12孔板的第2和第3列（共计6孔），HEp-2细胞种植在12孔板的第2和第4列（共计6孔）。种植细胞的12孔板置于湿盒内并37℃温箱和5%CO2培养。
    2.病毒培养
    （1）临床送达的病毒培养标本，如果24小时内能够接种，则放置2～8℃保存，否则冻存于-80℃冰箱内。
    （2）新鲜标本或自-80℃冰箱化冻的标本，接种前握拭子柄对标本管壁反复挤压拭子头，以便更多的可疑病毒标本挤入VTM，弃去拭子于消毒液内。如果是无拭子的疱疹液标本，仅将标本（VTM）混匀接种即可。
    （3）在12板标记需要接种的标本编号，用无菌塑料吸管吸去待接种孔内的细胞培养液，按照0. 5ml（VTM）／孔接种标本，每次接种设置阴性对照。每次更换培养液和（或）复苏新的细胞株时进行阳性质控，使用CMV病毒（CMV AD169株）和HSV-1病毒（SM44株）作为质控株，阳性质控株单美国独接种一块12孔细胞培养板，不与临床标本接种同一块细胞培养板，以避免可能污染临床标本结果。
    （4）接种标本后的12孔细胞培养板进行离心培养，使用美国BECKMAN公司的J6-MC离心机，2000转／分钟，35℃离心60分钟。离心后的12孔细胞培养板置于35.5℃和5%CO2温箱吸附1小时，然后吸去接种物，加入病毒培养液（1%FBS DMEM培养基，含万古霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml和二性霉素B 2.5μg/ml），病毒培养液加入量为每孔1.5～2ml，12孔细胞最终置于35.5℃和5%CO2温箱培养，每日观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。接种后3～4天更换病毒培养液1次。
    3.病毒培养鉴定 当病毒在培养细胞中生长时，可出现明显的CPE，表现为细胞肿胀变圆，折光性增强，有些呈葡萄串样改变，最终可见感染细胞死亡脱落。
    （1）一旦细胞出现明显的CPE应立即保存阳性培养物，并进行鉴定，使用直接荧光法（DFA）。保存阳性培养物：将CPE孔内的病毒培养液吸出后加入含1滴20% BSA溶液的2ml无菌管内并- 80℃冰箱保存。DFA鉴定：无菌0.01moI/L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入3滴消化液，37℃消化10分钟，2ml细胞生长液再悬浮消化后的细胞并吸回至试管内，塑料吸管在试管内反复吹打数次，PBS洗涤2次（1000转／分钟离心3分钟）。最终0.5ml的PBS再悬浮，滴10孔玻片一张，保留剩余可疑感染细胞悬液备用。滴片后的玻片在生物安全柜内吹干，冷丙酮固定15分钟，取出后晾干。分别滴加荧光素标记的抗疱疹病毒的单克隆抗体，滴加量约每孔10μl，均为美国LIGHT DIAGNOSTICSTM Chemicon International公司产品，现为Millipore公司。
    1）巨细胞病毒（CMV）。
    2）单纯疱疹病毒1型（HSV-1）。
    3）单纯疱疹病毒2型（HSV-2）。
    4）带状疱疹-水痘病毒（VZV）。
    （2）37℃湿盒内温育30分钟，PBS洗片2次，DW漂洗1次。晾干后封片甘油封片。荧光显微镜下观察结果。
    （3）接种后10天仍然未出现CPE的接种孔，仍然使用上述荧光标记的抗疱疹病毒单克隆抗体DFA方法进行染色抗原检测，以防止极少数情况下有病毒培养生长，但产生的CPE不明显。操作方法同于出现CPE病变的培养孔。
    【参考范围】
    正常人群疱疹病毒培养阴性。
    【临床意义】
    由于呼吸道病毒感染具有相似的临床症状和体征，因此病原学诊断只能依靠实验室检测。上述任何呼吸道病毒培养阳性应考虑为致病病原体。
    【标本要求】
    本检验项目涉及甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒1型（PARAl）、副流感病毒2型（PARA2）、副流感病毒3型（PARA3）、副流感病毒4型（PARA4）、腺病毒（Aden）和呼吸道合胞病毒（RSV）培养及鉴定。
    标本为鼻拭子标本。拭子管为意大利Copan公司产品，分为两种，尼龙植绒头铝杆细拭子用于儿童，塑料粗杆拭子用于成人。标本采集方法是旋转拭子管柄（盖），取出无菌拭子，将拭子垂直于患者的面部插入一侧鼻孔至鼻腭部，并停留几秒钟，然后边慢慢旋转并拔除拭子。在拭子管内倒入3ml含抗生素及保护蛋白的运输液（viral transport medium，VTM），立即再将取样后的拭子标本放置其中，在管上记录患者的ID。采集后并置于VTM的拭子标本应立即送至检验科病毒室，如不能，应将标本放置在2～8℃冷藏（请勿冷冻），24小时内应送至病毒室。拭子管标本在运输过程中不可倒置，以免标本遗洒。
    【方法与原理】
    离心细胞培养技术（shell vial culture，SVC）和荧光标记的单克隆抗体直接染色法（direct fluorescent antibody，DFA）。通过物理离心力作用将标本中的可疑病毒颗粒（附着在细胞或碎片中）压挤附着在培养细胞上，从而大大提高病毒培养的敏感性，并缩短培养时间。通过荧光标记的单克隆抗体染色病毒增殖后的感染细胞，在免疫学及形态学两方面对其快速鉴定。
    【操作步骤】
    1.细胞培养
    （1）基本设备：美国Baker公司的A/B3生物安全柜（用于细胞和病毒培养）、Nikon公司TMS倒置显微镜、美国BECKMAN J6-MC离心机及配套的细胞培养板架。Olympus公司的X71倒置荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax 2020型洗涤摇床等。
    （2）细胞株：人胚肺成纤维细胞（MRC-5）和人喉癌细胞（HEp-2）。细胞培养液为10%胎牛血清（美国HyClone公司）Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM，Sigma公司）培养基，含50μg／ml庆大霉素（Sigma公司）。
    （3）细胞传代及12孔板内单层细胞的设置：细胞传代为每周一和周五进行，具体为周1传代设置周3～5使用的细胞，周5传代设置下周1～2使用的细胞。
    （4） 75cm2的培养瓶（美国Corning-Costar公司）内的MRC-5和HEp-2细胞生长成为单层细胞后，无菌0. 01mol/L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入2ml消化液（0. 05%胰酶和0.02%EDTA钠盐混合溶液），快速均匀覆盖细胞面后倾去多余的消化液，37℃温箱内消化10分钟，用10ml细胞生长液吹下细胞，并吹打数次再悬浮，取：
    1）周1传代设置
    MRC-5细胞
    ◆2ml细胞悬液+10ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留1ml+19ml细胞培养液（继续传代使用）
    2）周5传代设置
    MRC-5细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留3ml+17ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    （5）与细胞培养液混合后的稀释的细胞悬液按照每孔2ml的量种植于12孔细胞培养板内，MRC-5细胞种植在12孔板的第1和第3列（共计6孔），HEp-2细胞种植在12孔板的第2和第4列（共计6孔）。种植细胞的12孔板置于湿盒内并37℃温箱和5%CO2培养。
    2.病毒培养
    （1）临床送达的呼吸道病毒培养标本，如果24小时内能够接种，则放置2～8℃保存，否则冻存于-80℃冰箱内。
    （2）新鲜标本或自-80℃冰箱化冻的标本，接种前握拭子柄对标本管壁反复挤压拭子头，以便更多的可疑病毒标本挤入VTM，弃去拭子于消毒液内。
    （3）在12板标记需要接种的标本编号，用无菌塑料吸管吸去待接种孔内的细胞培养液，按照0. 5ml（VTM）／孔接种标本，每次接种设置阴性对照。每次更换培养液和（或）复苏新的细胞株时进行阳性质控，使用甲型流感病毒Al/京科／96-25（来自国家流感中心）和呼吸道合胞病毒ATCC VR1580作为质控株，阳性质控株单美国独接种一块12孔细胞培养板，不与临床标本接种同一块细胞培养板，以避免可能污染临床标本结果。
    （4）接种标本后的12孔细胞培养板进行离心培养，使用美国BECKMAN公司的J6-MC离心机，2000转／分钟，35℃离心60分钟。离心后的12孔细胞培养板置于35.5℃和5%CO2温箱吸附1小时，然后吸去接种物，加入病毒培养液（1%FBS DMEM培养基，含万古霉素50μg／ml，庆大霉素50μg/ml和二性霉素B 2.5μg／ml），病毒培养液加入量为每孔1.5～2ml，12孔细胞最终置于35.5℃和5% CO2温箱培养，每日观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。接种后3～4天更换病毒培养液1次。
    3.病毒培养鉴定
    （1）当病毒在培养细胞中生长时，可出现明显的CPE，表现为细胞肿胀变圆，折光性增强，有些呈葡萄串样改变，最终可见感染细胞死亡脱落。
    （2）一旦细胞出现明显的CPE应立即保存阳性培养物，并进行鉴定，使用直接荧光法（DFA）。保存阳性培养物：将CPE孔内的病毒培养液吸出后加入含1滴20% BSA溶液的2ml无菌管内并- 80℃冰箱保存。DFA鉴定：无菌0. 01mol/L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入3滴消化液，37℃消化10分钟，细胞生长液再悬浮消化后的细胞并吸回至试管内，塑料吸管反复吹打数次，PBS洗涤2次（1000转／分钟离心3分钟）。最终0. 5ml的PBS再悬浮，滴10孔玻片一张，保留剩余可疑感染细胞悬液以备用。滴片后的玻片在生物安全柜内吹干，冷丙酮固定的抗呼吸道病毒的单克隆抗体，滴加量约每孔10μl，均为美国 LIGHT DIAGNOSTICSTM Chemicon International公司产品，现为Millipore公司。
    1）流感病毒甲型。
    2）流感病毒乙型。
    3）副流感病毒1型。
    4）副流感病毒2型。
    5）副流感病毒3型。
    6）腺病毒。
    7）呼吸道合胞病毒。
    （3）37℃湿盒内温育30分钟，PBS洗片2次，DW漂洗1次。晾干后封片甘油封片。荧光显微镜下观察结果。
    （4）接种后10天仍然未出现CPE的接种孔，使用上述7种混合的荧光标记的呼吸道病毒单克隆抗体（LIGHT DIAGNOSTICSTM Respiratory Viral Screen DFA）进行染色抗原检测，以防止极少数情况下有病毒培养生长，但产生的CPE不明显。操作方法同于出现CPE病变的培养孔。
    【参考范围】
    正常人群呼吸道病毒培养应为阴性，驻留罕见。
    抗沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体IgG和IgM抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    沙眼衣原体L2/43 4/Bu株、肺炎衣原体CWL-029（ATCCVR1310）株和鹦鹉热衣原体6BC株接种BGMK细胞株（绿猴肾细胞），超声波破碎感染细胞，释放衣原体，阶层梯度密度离心纯化衣原体抗原（EBs）。将纯化的沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体抗原经1%甲醛固定后分别滴涂在特殊印制的28孔载玻片上，再次丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在-20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体IgG和IgM抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1. Wang SP，Kuo CC，Grayston JT. Formalinized Chlamydia trachomatis organisms as antigen in the micro-immunofluorescence test.J Clin Microbiol，1979，10:259
    2. Grayston JT，Campbell LA，Kuo CC，et al.A new respiratory tract pathogen:Chlamydia pneumoniae strain TWAR.J Infect Dis，1990，161:618
    3.Moss TR，Darougar S，Woodland RM，et al.Antibodies to Chlamydia species in patients attending a genitourinary clinic and the impact of antibodies to C pneumoniae and C psittaci on the sensi- tivity and specificity of C trachomatis serology tests. Sex Transm Dis，1993，20:61
    4.倪安平，王辉，董平，等.肺炎支气管炎和急性上呼吸道感染患者肺炎衣原体感染的研究.中华内科杂志，1995，34:388
    5. Ni AP，Ling GY，Yang L，et al.A seroepidemiologic study of C.pneumoniae，C. trachomatis and C.psittaci in different populations in the mainland of China. Scand J Infect Dis，1996， 28:553-557
    6.李丽，倪安平，于维琴.鹦鹉热衣原体肺炎一例.中华结核和呼吸杂志，1999 ，22：662
    7.Mahony JB， Coombes BK，Chernesky MA. Chlamydia and Chlamydophila//Murray PR， Baron EJ，Jorgensen JH. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington DC: ASM Press，2003:991-1004
    抗弓形虫IgG抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    弓形虫RH株接种Vero细胞，增殖后经纯化、甲醛固定后滴涂在印制的28孔片上。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在-20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗弓形体IgG抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1.中华人民共和国卫生行业标准.刚地弓形虫血清学试验临床应用和解释（草案）——Clini- cal Use and Interpretation of Serologic Tests for Toxoplasma gondii； Approved Guideline， WS/T××X-200×
    2.Smith SB，Repetti CF. Evaluation of a rapid screening immunoassay for antibodies to Toxo- plasma gondii.J Clin Microbiol，1987，25:2207-2208
    3. Moyer NP， Hudson JD， Hausler WJ Jr.Evaluation of MUREX SUDS Toxo test.J Clin Microbi01，1987，25:2049-2053
    4.倪安平，郝英英，朱晓春，等.孕产妇四种病原体感染的血清学筛查的研究，中华检验医学杂志，2003，26:142-144
    抗风疹病毒IgG抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    风疹病毒Gos株感染Vero细胞，经消化洗涤后滴涂在印制的28孔片上，自然干燥后丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在-20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗风疹病毒IgG抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1. Hossain A，Ranua S，Bakir TM- Comparison of haemagglutination test， enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunofluorescence antibody test for determination of rubella immune status.J Trop Med Hyg，1988，91:216-221
    2.Kleeman KT， Kiefer DJ， Halbert SP. Rubella antibodies detected by several commercial
    immunoassays in hemagglutination inhibition-negative sera.J Clin Microbiol， 1983， 18: 1131-1137
    3.Zartarian MV，Friedly G，Peterson EM，et al.Detection of rubella antibodies by hemaggluti- nation inhibition， indirect fluorescent-antibody test， and enzyme-linked immunosorbent assay.J Clin Microbiol，1981，14: 640-645
    4.倪安平，郝英英，朱晓春，等.孕产妇四种病原体感染的血清学筛查的研究.中华检验医学杂志，2003，26:142-144
    抗单纯疱疹病毒（1+2型）IgG抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    单纯疱疹病毒SM44（HSV-1）和G株（HSV-2）分别接种HEp-2细胞，待完全出现细胞病变后，胰酶消化HSV-1和HSV-2感染细胞，并将HSV-1和HSV-2感染细胞等量混合，PBS洗涤后滴涂印制的28孔片，丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在- 20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗单纯疱疹病毒（1+2型）IgG抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1. Pacsa AS，Pejtsik B. Detection of antibodies to cytomegalovirus，herpes simplex virus and rubella virus with the micro-enzyme immunoassay. Acta Microbiol Acad Sci Hung，1979， 26:35-40
    2.Islah H.El Falaky，Bent Faber Vestergaard，Allan Hornsleth.IgG，IgA and IgM antibodies response in patients with acute genital and non-genital herpetic lesions determined by the indirect fluorescent antibody method. Scan J Infect Dis，1977，9:79-84
    3.倪安平，郝英英，朱晓春，等.孕产妇四种病原体感染的血清学筛查的研究.中华检验医学杂志，2003，26:142-144
    抗巨细胞病毒IgG抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    CMVAD169株感染人胚肺成纤维细胞。胰酶消化并破碎感染细胞，纯化细胞核包涵体，同时加入1／3的正常HEp-2细胞核用于内参阴性对照，上述混合的细胞核悬液滴涂在印制的28孔片上，自然干燥后丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在-20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗巨细胞病毒IgG抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1.Stagno S，Reynolds DW，Smith RJ. Use of isolated nuclei in the indirect fluorescent-antibody test for human cytomegalovirus infection:comparison with microneutralization，anticomple— ment，and conventional indirect fluorescent-antibody assays.J Clin Microbiol， 1978，7: 486-489
    2.倪安平，郝英英，朱晓春，等.孕产妇四种病原体感染的血清学筛查的研究.中华检验医学杂志，2003，26:142-144
    【临床意义】
    HBsAg是患者感染HBV后首先出现的标记物。可用于诊断乙肝病毒的感染，并监测乙型肝炎疾病的进展阶段。在判断急性或慢性乙肝时，应结合HBsAg阳性患者的病史和其他乙肝血清学标志结果综合进行诊断。
    【标本要求】
    1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
    2.采样量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay，CMIA）。定量检测人血清或血浆中的HBsAg。
    2.原理 利用单克隆Anti-HBsAg包被微粒子检测HBsAg的CMIA技术，通过两步法进行免疫测定。将样本和Anti-HBs包被顺磁微粒子合并。样本中存在的HBsAg便结合到Anti-HBs包被顺磁微粒子。洗涤后，加入吖啶酯标记Anti-HBs的结合物。再次洗涤之后，加入预激发液和激发液到反应混合物中。测定得到的化学发光反应，以相对发光值（RLU）表示。样本中的HBsAg数量与ARCHITECT i*系统光学检测的RLU之间成正比。
    样本中HBsAg的浓度是通过ARCHTITECT HBsAg标准曲线确定。如果样本浓度≥0. 051U/ml，该样本即可视为HBsAg阳性。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT i2000全自动免疫化学发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT HBsAg试剂盒
    （1）微粒子（1瓶）：在MES缓冲液中配制的Anti-HBs（鼠，单克隆，IgM，IgG）包被微粒子。
    （2）结合物（1瓶）：在MES缓冲液中制备的吖啶酯标记Anti-HBs（山羊，IgG）结合物。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32%（w/v）过氧化氢的预激发液。
    （2）激发液：含0.35mol／L氢氧化钠的激发液。
    （3）洗涤液：含磷酸盐缓冲液。
    （4）配套质控品：包含阳性质控品1、阳性质控品2和阴性质控品。
    （5）配套校准品：校准品1和校准品2。
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行校准时，以复管检测标准品1和2。校准范围：0～2501U／mL。ARCHITECT HBsAg的所有质控水平必须取一个样本进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。
    一旦ARCHITECT HBsAg校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目HBsAg，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
    质控要求每24小时取各个质控水平进行检测。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目HBsAg，选择F3-Add order，完成申请，在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。
    4.试剂装载检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 %CV≤11.9。
    2.灵敏度99. 52%。
    3.特异性99. 87%。
    【参考范围】
    ARCHITECT HBsAg结果判断：
    （1）样本浓度值＜0. 05IU/ml为阴性。
    （2）样本浓度值≥0.05IU／ml为阳性。
    （3）当HBsAg浓度值超过250IU／ml时，标记为＞250. 00IU／ml。
    【参考文献】
    1.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版.北京：人民卫生出版社，2007
    2.贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.临床肝胆病杂志，2011，1
    3.庄辉.乙型肝炎流行病学研究进展.国外医学：流行病学·传染病学分册，2004，3
    4.李金明，乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题.中华检验医学杂志，2006， 29（15）
    5.李金明，王露楠，徐锡霞，等.室内质量控制对乙型肝炎表面抗原测定准确度的影响.中华检验医学杂志，2001:24（4）：255
    6. Carmen WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. Journal of Viral hepatitis，1997，4 （Suppl.1）:11-20
    7. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Dis- eases Transmitted by Blood，Body Fluids and Tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu- ment M29-A（ISBN l-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
    8. NCCLS. Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods； Ap-proved Guideline - Second Edition NCCLS Document EP5-A2 ［ISBN 1-56238-542-9］. NC-CLS，940 West Valley Road，Suite 1400，Wayne，PA 19087-1898 USA，2004
    【临床意义】
    Anti-HBs常用于定量监测乙肝疫苗接种后的免疫应答，阳性个体可防止乙肝病毒（HBV）感染，对机体有保护作用。也可用于判断乙肝感染个体的血清转换和HBV急性感染的恢复。在无症状个体中检测到Anti-HBs也可提示既往HBV感染。
    【标本要求】
    1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
    2.采样量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法化学发光微粒子免疫测定法（CMIA）。定量检测人血清和血浆中的乙肝表面抗体（Anti-HBs）。
    2.原理样本和重组HBsAg（rHBsAg）包被顺磁微粒子合并。样本中存在的Anti-HBs便结合到rHBsAg包被微粒子上。洗涤后，加入吖啶酯标记rH-BsAg结合物。再次循环洗涤之后，加入预激发液和激发液到反应混合物中。测定由此得到的化学发光反应，以相对发光值（RLU）表示。样本中的Anti-HBs数量与系统光学检测的RLU之间成正比。利用前面产生的校准曲线测定样本中Anti-HBs的浓度。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT i2000全自动免疫发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT Anti-HBs试剂盒包括： （ 1）微粒子：用Tris缓冲液中配制的乙肝表面（E. coli，重组）抗原（亚型ad和ay）包被微粒子。
    （2）结合物：用MES缓冲液中配制的吖啶酯标记乙肝表面（E. coli，重组体）抗原（亚型ad和ay）结合物。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32%（W/V）过氧化氢的预激发液。
    （2）激发液：含0.35mol／L氢氧化钠的激发液。
    （3）洗涤液：含磷酸盐缓冲液。
    （4）配套质控品：包含阳性质控品1、阳性质控品2和阴性质控品。
    （5）配套校准品：校准品1和2
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibrationorder，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行校准时，以复管检测标准品1和2。校准范围：0～1000mIU/ml。ARCHITECT Anti-HBs的所有质控水平必须检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。一旦ARCHITECT Anti-HBs校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目Anti-HBs，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
    建议每24小时取各个质控水平进行检测。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下，可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目Anti-HBs，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
    4.试剂装载 检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 %CV≤13.4。
    2.灵敏度    97. 54%。
    3.特异性    99. 67%。
    【参考范围】
    ARCHTIECT Anti-HBs结果判读：
    （1）≥10. 0mIU／ml为阳性。
    （2）＜10. 00mIU/ml为阴性。
    （3）样本中Anti-HBs超过1000mIU/ml时，以＞1000. 00mIU/ml表示。
    【参考文献】
    1.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版.北京：人民卫生出版社，2007
    2.贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.临床肝胆病杂志，2011，1
    3.庄辉.乙型肝炎流行病学研究进展.国外医学：流行病学·传染病学分册，2004，3
    4.李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题.中华检验医学杂志，2006，29（15）
    5.黄利华.HBV血清标志物特殊模式的再认识.国外医学：流行病学·传染病学分册， 2002，2
    6.洪俊，饶永彩.全自动发光免疫分析仪在HBV血清标志物检查中的应用，职业与健康，2010，3
    7. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis- eases Transmitted by Blood，Body Fluids and tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu- ment M29-A（ISBN l-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
    【临床意义】
    HBeAg检测可用于监测HBV感染的进展状况和个体对药物治疗的反应。HBeAg阳性提示感染者具有高传染性。HBeAg的出现与血清中感染病毒（Dane颗粒）数量的增加、肝细胞核中核心颗粒和血清中HBV特定DNA及DNA聚合酶的出现有关。慢性HBV感染中，HBeAg可能与HBsAg -起持续存在。
    【标本要求】
    1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）；
    2.量 静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存 分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemilumlnescent Microparticle Immuno Assay，CMIA）。定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）。
    2.原理 ARCHITECT HBeAg检测项目是一种两步法免疫检测。第一步，混合样本、测试稀释液和抗-HBe（鼠，单克隆）包被顺磁微粒子。样本中的HBeAg结合至抗-HBe包被微粒子上。冲洗后进入第二步，加入吖啶酯标记的抗-HBe结合物。再次冲洗后，向反应混合物中加入预激发液和激发液。通过相对发光单位（RLUs）对产生的化学发光反应进行测量。样本中的HBeAg数量与ARCHITECT光学系统检测到的RLU有直接关系。对于样本中是否含有HBeAg，需要把反应产生的化学发光信号和以往ARCHITECT HBeAg校准生成的临界信号值进行比较。化学发光信号如低于样本信号临界值（S/CO），该样本可测定为HBeAg呈阴性。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT i2000全自动免疫发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT HBeAg测定试剂盒，包括：
    （1）微粒子：在磷酸盐缓冲液中配制的抗-HBe（鼠，单克隆）包被微粒子。
    （2）结合物：在MES缓冲液中配制的吖啶酯标记抗-HBe（鼠，单克隆）结合物。
    （3）稀释液：含复钙人血浆的磷酸盐缓冲液。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32% （W／V）过氧化氢。
    （2）激发液：含0.35mol／L的氢氧化钠。
    （3）清洗缓冲液：含磷酸盐的浓缩缓冲液。
    3.ARCHITECT Anti-HBs配套质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。
    4.ARCHITECT Anti-HBs配套校准品：校准品1。
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目HBeAg，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行校准时，需要对校准品1和2重复检测三次。所有HBeAg质控水平必须进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。一旦ARCHITECT HBeAg校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目HBeAg，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
   建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
    4.试剂装载检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 % CV≤10%（当S/CO≥1.000）；%CV≤22. 9%（当S/CO＜1. 000）。
    2.灵敏度≥99.5%。
    3.特异性≥99. 0%。
    【参考范围】
    ARCHITECT HBeAg测定结果解释：
    1.检测值S/CO＜1.0为阴性。
    2.检测值S/CO≥1.0为阳性。
    【参考文献】
    1.庄辉.我国乙型肝炎病毒感染与挑战.中华传染病杂志，2005，S1
    2.马慧，郭芳，魏来，等.HBeAg阴性和HBeAg阳性乙型肝炎肝硬化患者临床特征及预后的前瞻性研究.中华医学杂志，2007，26
    3.唐跃华，谢健敏.慢性乙型肝炎患者血清HBeAg、HBV-DNA与肝组织炎症关系的探讨，中华传染病杂志，2005，23（5）
    4.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版.北京：人民卫生出版社，2007
    5.李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题，中华检验医学杂志.2006， 129（15）
    6. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis-eases Transmitted by Blood，Body Fluids and tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu-ment M29-A（ISBN 1-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
    【临床意义】
    乙型肝炎e抗体（抗-HBe）的出现与乙型肝炎病毒（HBV）感染有关，阳性时提示病毒复制减弱，病毒数量减少，处于感染恢复期。急性乙肝感染期间HBeAg与抗-HBe的血清转换通常是提示HBV感染减轻和感染水平下降。慢性乙型肝炎的患者当血清没有检出HBeAg，但抗-HBe呈阳性，提示可能仍有乙肝病毒DNA复制。此外，在治疗慢性乙肝患者时，HBeAg/抗-HBe的血清转换可作为病毒应答的一个指标。
    【标本要求】
    1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
    2.量 静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存 分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent MicroparticleImmuno Assay，CMIA）。定性检测人血清和血浆中的抗-HBe。
    2.原理 ARCHITECT抗-HBe检测为两步免疫竞争测定。将样本、中和试剂和抗-HBe（鼠，单克隆）包被顺磁微粒子混合，样本中存在的抗-HBe与中和试剂中存在的重组HBeAg（rHBeAg）结合。未结合的rHBeAg与抗-HBe包被微粒子结合。洗涤后，在第二步加入吖啶酯标记的抗-HBe结合物。再次洗涤后，加入预激发液和激发液到反应混合物中。测定化学发光反应结果，以相对发光值（RLU）表示。样本中的抗-HBe含量与ARCHITECT i*系统光学检测的RLU之间成反比。通过比较反应中的化学发光信号和ARCHITECT抗-HBe校准检测的临界信号，判断检测样本中是否存在抗-HBe。如果反应中的化学发光信号大于ARCHITECT抗-HBe校准检测的临界信号，那么该样本为抗-HBe阴性。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT 12000全自动免疫发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT抗-HBe试剂盒，包括：
    （1）微粒子：TRIS缓冲液配制的抗-HBe（鼠，单克隆）包被微粒子。
    （2）结合物：MES缓冲液配制的吖啶酯标记抗-HBeAg（鼠，单克隆）结合物。
    （3）中和试剂：TRIS缓冲液配制的重组HBeAg。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32%（W／V）过氧化氢的预激发液。
    （2）激发液：含0.35mol／L氢氧化钠的激发液。
    （3）洗涤液：磷酸盐浓缩缓冲液。
    3.ARCHITECT抗-HBe配套质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。
    4.ARCHITECT抗-HBe配套校准品：校准品1。
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行抗-HBe校准时，需要对校准品1重复检测三次。所有质控水平必须取一个样本进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。
    一旦ARCHITECT抗-HBe校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目抗-HBe，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
    建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定 在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目抗-HBe，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
    4.试剂装载 检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 %CV≤10. 0%；
    2.灵敏度≥97. 54%。
    3.特异性≥99. 67%。
    【参考范围】
    结果解释：
    1.样本S/CO值＞1. 00为抗-HBe阴性。
    2.样本S/CO值≤1.00为抗-HBe阳性。
    【参考文献】
    1.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版.北京：人民卫生出版社，2007
    2.贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.临床肝胆病杂志，2011，1
    3.谢士达，刘成永，高玉金，等.HBeAg和抗-HBe血清学转换的动态变化对拉米夫定疗效的评价，肝脏，2005，（04）
    4.张国庆，白娜，田巧.HBV DNA定量与乙肝病毒标志物及肝功能的相关性分析，中外医疗，2011，（03）
    5.李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题，中华检验医学杂志，2006， 29（15）
    6. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis-eases Transmitted by Blood，Body Fluids and Tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu-ment M29-A（ISBN l-56238-339-6）. NCC LS，Wayne，PA 19087； 1997
    【临床意义】
    Anti-HBc可用于监测HBV感染，提示被检者可能是活动性感染或提示处于感染恢复期。在其他HBV指标都缺乏的情况下，被检者应视为已被HBV感染。在没有其他感染指标的情况下，Anti-HBc可能是HBV感染和血液潜在感染的唯一的血清学标志。
    【标本要求】
    1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
    2.量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent Microparticle Im-muno Assay，CMIA）。定性检测人血清和血浆中的乙肝核心抗体（Anti-HBc）。
    2.原理 ARCHITECT Anti-HBc检测是一种两步法免疫测定。首先将样本、检验稀释液和HBc抗原包被顺磁微粒子合并。样本中存在的Anti-HBc便结合到HBc抗原包被微粒子上。洗涤后，在第二步加入吖啶酯标记抗-人结合物。再次洗涤后，加入预激发液和激发液到反应混合物中。测定化学发光反应结果，以相对发光值（RLU）表示。样本中的Anti-HBc数量与ARCHITECT i*系统光学检测的RLU之间成正比。通过比较反应中的化学发光信号和ARCHI-TECT Anti-HBc校准确定的临界信号，判断检测样本中是否存在Anti-HBc。如果反应中的化学发光信号大于或等于临界信号，该样本即可视为Anti-HBc阳性。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT 12000全自动免疫发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT Anti-HBc试剂盒
    （1）微粒子（1瓶）：用MOPSO缓冲液配制的HBc（E.coli，重组）抗原包被微粒子。
    （2）结合物（1瓶）：MES缓冲液配制的吖啶酯标记抗-人（鼠，单克隆）结合物。
    （3）检验稀释液：用MOPSO缓冲液配制的Anti-HBc检验稀释液。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32%cw/v）过氧化氢的预激发液。
    （2）激发液：含0.35mol/L氢氧化钠的激发液。
    （3）洗涤液：含磷酸盐缓冲液。
    3.ARCHITECT Anti-HBc配套质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。
    4.ARCHITECT Anti-HBc配套校准品：校准品1。
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Caliorationorder，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行Anti-HBc校准时，需要对校准品1重复检测三次。Anti-HBc所有质控水平必须取一个样本进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。
    一旦ARCHITECT Anti-HBc校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目Anti-HBc，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
    建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定 在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目Anti-HBc，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
    4.试剂装载 检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 %CV≤22.1%。
    2.灵敏度≥98. 63%。
    3.特异性≥99. 42%。
    【参考范围】
    结果解释：
    1.样本S/CO值＜1. 00为阴性。
    2.样本S/CO值≥1.00为阳性。
    【参考文献】
    1.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版，北京：人民卫生出版社，2007
    2.贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.临床肝胆病杂志，2011，1
    3.庄辉.乙型肝炎流行病学研究进展.国外医学：流行病学·传染病学分册，2004，3
    4.李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题.中华检验医学杂志，2006， 29（15）
    5.李金明.感染性疾病免疫测定的室内质量控制.医学检验与临床，2007，18（1）
    6. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis-eases Transmitted by Blood，Body Fluids and Tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu-ment M29-A（ISBN 1-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
    【临床意义】
    甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）属于微小RNA病毒，具有嗜肝性，其宿主范围狭窄，只感染人和几种高等灵长类动物。HAV为无囊膜病毒颗粒，内含RNA基因，外层为衣壳蛋白包裹。抗HAV IgM为HAV衣壳蛋白抗体。抗HAV IgM阳性，表明机体正在感染HAV，是早期诊断甲型肝炎的特异型指标。抗HAV IgM阳性率在发病2周为100%，1个月76.5%，3个月为23. 5%，6个月为5. 9%，12个月时为阴性。但有些感染者抗HAV IgM维持时间很短（约1周），且仅为临界值。也有一些患者抗HAV IgM应答“缺失”，即血中未能测出抗HAV IgM，此类患者可借助于抗HAV IgM呈上升表现或参考HAVAg来确诊甲型肝炎。
    在慢性乙型肝炎或自身免疫性肝病患者血清中检测抗HAV IgM阳性时，判断HAV重叠感染应慎重，须排除类风湿因子（RF）及其他原因引起的假阳性。接种甲型肝炎疫苗后2～3周约8%～20%接种者可产生抗HAV IgM，应注意鉴别。
    【标本要求】
    1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
    2.标本量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存血清或血浆标本分离后7天之内可放置于2～8℃保存，超过7天在-20℃保存。
    【仪器】
    酶标仪，洗板机和振荡器。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫法。
    2.原理 抗人IgM抗体（μ链）包被酶免疫微孔板，加入待检血清标本后，与血清中全部IgM抗体结合（捕获），如果被捕获的抗体存在特异性的抗HAVIgM抗体，则与随后加入的HAV抗原结合，同时加入辣根过氧化物酶标记的抗HAV抗体再与HAV抗原结合，辣根过氧化物酶催化加入的底物溶液显色。颜色深浅与血清中甲型肝炎IgM抗体的量成正比。
    【试剂】
    上海实业科华生物技术有限公司产品。
    1.抗人IgM抗体（μ链）包被的酶免疫微孔板。
    2.HA抗原溶液。
    3.酶结合物，即辣根过氧化物酶标记的抗HAV抗体。
    4.抗-HAV IgM阳性和阴性对照。
    5.浓缩洗涤液（0. 4mol／L Tris），用时需1: 20稀释。
    6.底物液TMB。
    7.终止液（2nlol/LH2SO4）。
    【操作步骤】
    1.按照所需数量在板架上放好酶标板条，按顺序编号。
    2.待测标本血清或血浆用生理盐水1：1000稀释，每孔加入稀释后的标本100μl及阴、阳性对照100μl于相应孔中，设空白对照孔（加100μl洗涤液），封板，置37℃温育20分钟。
    3.洗涤 用洗涤液洗5次。
    4.除空白对照孔外，每孔加入HAV抗原30μl、酶结合物各50μl，振荡均匀，置37℃20分钟。
    5.同步骤3洗涤。
    6.每孔加底物液A液和B液各每孔50μl，振荡混匀，置37℃温育10分钟。
    7.每孔中加50μl终止液。
    8.在450nm波长测定OD值，用空白孔校零，读取OD值。
    9.结果判定：临界值（COV）=阴性对照平均OD值×2.1
    （当阴性对照孔OD值小于0.05时，按0.05计算）。
    （1）标本OD值＜COV，为阴性。
    （2）标本OD值≥COV，为阳性。
    【参考范围】
    阴性。
    【参考文献】
    1.刘锡光，祁自柏.病毒性肝炎实验诊断学.北京：人民卫生出版社，1999:357
    2.李金明.临床酶免疫测定技术.北京：人民军医出版社，2005:87
    3.病毒性肝炎防治方案.传染病信息，2000，（04）：
    4. Duermeywe W.A new principle for the detection of specific IgM antibodies applied in an ELISA for hepatitis A.J Med Vir01，1979，4（1）:25
    5.Duermeywe W. Specific detection of IgM-antibodies by ELISA，applied in hepatitis A.Lan-cet，1978，2（8091）：684
   
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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验101-110

作者:王泓  日期:2014-06-19

101.丙型肝炎病毒抗体（Anti-HCV）

【临床意义】
HCV抗体阳性提示个体可能感染过HCV病毒、或可能为HCV病毒携带者并具有传染性。尽管大部分被感染者没有症状，但是HCV病毒持续感染可以发展为慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。通过对献血液者进行筛选可以使输血传播HCV的风险显著下降。
【标本要求】 1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
2.采样量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.保存分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
【方法与原理】
1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay，CMIA）。定性检测人血清和血浆中的丙型肝炎病毒抗体（Anti-HCV）。
2.原理 ARCHITECT HCV抗体检测是一种两步免疫检测法。首先，样本与HCV重组抗原包被顺磁微粒子和测试稀释液混合。样本中的HCV抗体结合至丙肝病毒包被微粒子上。冲洗后，加入抗-人IgG吖啶酯标记的结合物。再次冲洗之后，向反应混合物中加入预激发液和激发液。通过相对发光单位（RLUs）对产生的化学发光反应进行测量。样本中的丙肝病毒抗体数量与ARCHITECT i*光学系统检测到的RLU成正比。把反应产生的化学发光信号和系统校准生成的临界信号值进行比较。化学发光信号如大于或等于临界信号值，该样本可测定为HCV抗体阳性。
【仪器】
美国雅培公司ARCHITECT 12000全自动免疫发光分析仪。
【试剂】
1.美国雅培公司ARCHITECT Anti-HCV测定试剂盒
（1）微粒子：在MES缓冲液中配制的HCV（大肠杆菌，酵母，重组体）包被微粒子。
（2）结合物：在MES缓冲液中制备的吖啶酯标记鼠抗-IgG／抗-IgM结合物。
（3）检测稀释液：TRIS缓冲液制备的测试稀释液。
2.其他试剂
（1）预激发液：含1.32% （W／V）过氧化氢。
（2）激发液：含0.35mol／L氢氧化钠。
（3）洗涤液：在TRIS缓冲液中制备的HCV抗体测试稀释液。
3.ARCHITECT Anti-HCV配套质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。
4.ARCHITECT Anti-HCV配套校准品：校准品1。
试剂盒在ARCHITECT i系统上最长可以储存30天。30天后，必须丢弃试剂盒。
【操作步骤】
1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
执行ARCHITECT Anti-HCV校准时，需要对校准品1重复检测三次。Anti-HCV所有质控水平必须取一个样本进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。一旦ARCHITECT Anti-HCV校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
（1）使用新批号的试剂盒。
（2）质控值在范围之外。
2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目Anti-HCV，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
（1）更换试剂批号。
（2）重新定标后。
（3）质控值在规定范围之外。
（4）仪器移动或故障维修后。
3.样本测定在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目Anti-HCV，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
4.试剂装载检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
【性能参数】
1.精密度 %CV≤13.1。
2.灵敏度 97.10%。
3.特异性 99. 60%。
【参考范围】
结果解释：
1.S/CO＜1.0为阴性。
2.S/CO≥1.0为阳性。
3.其中S/CO介于1.0～4.0（ARCHITECT i2000）之间的检测值应视为灰区范围，需进一步复检。如复检结果仍为阳性，样本应使用其他特异性免疫检测法或免疫印迹法（RIBA）进行检验。
【参考文献】
1.刘丽君，魏来.丙型肝炎病毒的流行病学.传染病信息，2007，20:261-264
2.杨瑞锋，魏来.丙型肝炎病毒感染的检测.临床肝胆病杂志，2011，27：（1）
3. Alter MJ，Kuhnert WL，Finelli L，et aL Guidelines for laboratory testing and result repor- ting of antibody to hepatitis C virus. MMWR Recomm Rep，2003，52（RR-3）:1-16
4.NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis-eases Transmitted by Blood，Body Fluids and Tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu- ment M29-A（ISBN 1-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
5. Lee Dong-Soon. Significance of anti-E2 in the diagnosis of HCV infection in patients on maintenance hemodialysis. Journal of the American Society of Nephrology，1996，7 （11）: 2409-2413
【临床意义】
HEV属杯状病毒，粪-口途径传播，与甲肝相似，为急性发病并具有自限性，较少发展为慢性。急性期血清抗戊型肝炎病毒抗体IgM（抗HEV IgM）阳性可诊断为HEV感染。
【标本要求】
1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.标本量 静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.保存 血清或血浆标本分离后7天之内可放置于2～8℃保存，超过7天在-20℃保存。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫法。
2.原理 兔抗人IgMμ链包被酶免疫微孔板，加入待测定血清后，可捕获血清／浆中的HEV IgM抗体，当加入辣根过氧化物酶标记的基因重组抗原（HEVAg HRP）后，血清HEV IgM抗体与HEVAg HRP结合。辣根过氧化物酶催化加入的底物（TMB）溶液显色，其颜色深浅与血清或血浆中的HEV特异性IgM含量成正比。
【仪器】
酶标仪，洗板机和振荡器。
【试剂】
上海实业科华生物技术有限公司产品。
1.兔抗人IgMμ链包被微孔板。
2.酶结合物辣根过氧化物酶标记的基因重组抗原（HEVAg HRP）。
3.HEV IgM阳性和阴性对照。
4.样品稀释液。
5.浓缩洗涤液。
6.底物液（TMB）。
7.终止液（2mol／L H2SO4）。
【操作步骤】
1.按照所需数量在板架上放好酶标板条，按顺序编号。
2.每孔加入100μl样品稀释液，再加入待检标本10μl充分混匀。设立阴性、阳性及空白对照，各加100μl阴性及阳性对照（不用稀释），设空白对照。
3.置37℃温育30分钟。
4.用洗涤液洗板5次。
5.每孔加酶结合物100μl，空白对照不加。
6.振荡均匀，置37℃温育30分钟。
7.用洗涤液洗板5次。
8.每孔加底物液A液及B液各50μl，振荡均匀，置37℃温育10分钟。
9.每孔中加终止液50μl。
10.在450nm波长测定OD值，用空白对照校零。
11.结果判定
（1） Cut-off值计算：Cut-off=0.25+阴性对照平均OD值
（2）结果判定：标本OD值≥Cut-off值为阳性。标本OD值＜Cut-off值为阴性（阳性对照OD值低于1.3或阴性对照OD值高于0.15，检测结果无效）。
【性能参数】
1.敏感性 100%。
2.特异性 100%。
3.精密度 ≤15%。
【参考范围】
阴性。
【参考文献】
1.李金明，胡志东，钟述猷.戊型肝炎研究新进展.国外医学：流行病学·传染病学分册2004，（04）
2.王佑春.中国戊型肝炎病毒4型的流行病学、分子生物学和家畜感染研究.中华流行病学杂志，2003，（07）
3.病毒性肝炎防治方案.传染病信息，2000，（04）
4.庄辉.重视戊型肝炎研究.中华肝脏病杂志，2004，（01）
5.赵晨燕，李卓，郝娃，等.戊型肝炎病毒抗体检测试剂的比较.中国生物制品学杂志，2010， （03）
【临床意义】
RPR为梅毒血清学非特异性实验。某些自身免疫性疾病患者（如SLE、硬皮病）及孕妇等会出现生物学假阳性反应，但多为弱反应。RPR阳性标本应做梅毒螺旋体特异性试验加以确诊。虽然RPR结果为非特异性，但敏感性较高，操作方便，因此作为梅毒的快速筛选试验。另外，抗脂质抗体（反应素）与临床症状有较好的关联，半定量结果可用于疗效判断和观察预后。
【标本要求】
普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
【方法与原理】
1.方法非特异性间接凝集反应。
2.原理梅毒螺旋体感染机体后，在破坏组织的过程中，释放出一种抗原性磷脂，它能刺激人体产生反应素，检测时用人工合成的类脂质抗原（致敏在活性炭颗粒上）与被检血清反应，发生凝集，提示血清中有该反应素，用于梅毒早期实验室筛查。
【仪器】
混旋器。
【试剂】
上海实业科华生物技术有限公司产品。
1.RPR抗原 用类脂质抗原（心磷脂、卵磷脂、胆固醇等）致敏的活性炭颗粒。
2.质控品 阳性、阴性对照。
3.配套品 RPR反应卡片及塑料加液滴管（每滴约17μl）。
【操作步骤】
1.取待检血清50μl加于卡片上（包括阳性、阴性对照），并涂满整个卡圈。
2.在每份血清上加1滴RPR抗原。
3.放在混旋器上旋转8分钟肉眼观察结果。阳性结果判断：标本反应液中出现黑色凝集颗粒或絮片。阴性结果判断：不出现黑色凝集颗粒。RPR反应阳性标本，依反应强弱做1: 2～1：32倍稀释，操作方法同上，以确定滴度（半定量）。
【参考范围】
阴性。
【参考文献】
1.杨芳，邢文革.梅毒检测策略的应用现状，中国艾滋病性病，2009，15（5）：549-555
2.陈祥生.我国梅毒流行现状及防治策略.国际流行病学传染病学杂志，2008，35（2）：73-77
3.彭锐锐，李婧，陈祥生.梅毒螺旋体分子流行病学研究进展，中国艾滋病性病，2010，16（2）： 192-194
【临床意义】
梅毒螺旋体抗体（含IgG、IgM）检测主要用于对梅毒患者的辅助诊断。梅毒是由TP螺旋体感染引起，可通过先天遗传或性交传播。潜伏期内的梅毒感染在临床上表现不显著。梅毒螺旋体抗体检测，具有较高的敏感性和特异性，适合于对大量标本的筛查，但因其也存在非特异性反应，故阳性标本还应进一步做确证试验（TPPA、TPHA、FTA-ABS等）。由于该检测含IgG型抗体，所以即使在抗原消失后，抗体仍可长时间存在，甚至终身携带，因此其结果不能作为疗效观察和判断复发的指标。
【标本要求】
1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
2.量 静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.保存 分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
【方法与原理】
1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay，CMIA）。采用两步法，定性检测人血清或血浆中的TP抗体。
2.原理首先将样本、重组TP抗原（TpN15、TpN17和TpN47）包被的微粒子和稀释液混合。样本中的抗TP抗体将与TP包被的微粒子相结合。冲洗后加入抗人吖啶酯标记的IgG和IgM结合物。再次冲洗后，向反应混合液中加入预激发液和激发液。测量化学发光反应的结果，以相对发光单位（RI.Us）表示。样本中的抗TP抗体含量和ARCHITEC i*光学系统检测到的RLUs值成正比。将测得的化学发光信号与系统校准确定的cutoff值进行比较，从而确定样本中是否存在抗TP抗体。如果样本的化学发光信号大于或等于cutoff值，那么说明该样本对TP抗体呈反应性。
【仪器】
美国雅培公司ARCHITECT 12000全自动免疫发光分析仪。
【试剂】
1.美国雅培公司ARCHITECT Syphilis TP测定试剂盒
（1）微粒子：包被了TP（大肠杆菌，重组体）抗原的微粒子。
（2）结合物：标记了吖啶酯的鼠IgG抗体／IgM抗体的结合物。
（3）稀释液，含MES的缓冲液。
2.其他试剂
（1）预激发液：含1.32%（W/V）过氧化氢。
（2）激发液：含0.35moI/L的氢氧化钠。
（3）清洗缓冲液：含磷酸盐的浓缩缓冲液。
3.ARCHITECT Syphilis TP配套质控品：阳性质控品和阴性质控品。
4.ARCHITECT Syphilis TP配套校准品：校准品1。
试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
【操作步骤】
1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
执行Syphilis TP校准时，需要对校准品1重复检测三次。Syphilis TP的所有质控水平样本必须进行检测，用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。一旦校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
（1）使用新批号的试剂盒。
（2）质控值在范围之外。
2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中Control order，选择要分析的项目Syphilis，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
（1）更换试剂批号。
（2）重新定标后。
（3）质控值在规定范围之外。
（4）仪器移动或故障维修后。
3.样本测定 在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目Syphilis，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
4.试剂装载 检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
【性能参数】
1.精密度 %CV≤15%。
2.灵敏度 ≥99.0%。
3.特异性 ≥99.0%。
【参考范围】
1.S/CO值＜1.0时为无反应性。
2.S/CO值≥1.0的样本为有反应性。
【参考文献】
1.侯晓菁，梁艳，陈洁，等.化学发光法检测梅毒螺旋体特异性抗体的实验评价.检验医学 2010，（5）：
2.熊继红，卢建强.化学发光法与ELISA法检测梅毒抗体的一致性比较，检验医学与临床， 2011， （3）
3.刘惠.北京市1994～1998年梅毒流行病学分析.中华流行病学杂志，2000，（2）
4. Carvalho L，Largua A. The use of an automated chemiluminescent assay for screening of syphilis diagnostic. Clin Chem Lab Med，2008，46:339-340
5. Meyer JC. Laboratory Diagnosis of Syphilis. Curr Probl Dermat01，1996，24:1-11
6. NCCLS.Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods； Approved Guideline-Second Edition.NCCLS Document EP5-A2 （ISBN l-56238-542-9）. NCCLS，940 West Valley Road，Suite 1400，Wayne，Pennsylvania 19087-1898 USA，2004
【临床意义】
多年来国内常用的梅毒确认试验为梅毒螺旋体血凝试验（TPHA），该试剂是用梅毒螺旋体为抗原致敏醛化的禽类红细胞制成，由于红细胞具有生物活性，可能产生非特异性凝集，且保存时间较短，故近年来推出换代产品TPPA试验。TPPA以纯化的梅毒螺旋体抗原致敏情性的人工明胶颗粒替代TPHA试验中的致敏红细胞，使结果更为稳定，敏感性和特异性也得到进一步提高。TPPA检测的是梅毒螺旋体特异性抗体，包括IgM型和IgG型，可作为梅毒的确证试验，但不适合用作治疗效果的监测。
【标本要求】
普通管静脉血2～3ml，常规分离血清后，2～8℃保存7天。
【方法与原理】
1.方法 梅毒螺旋体明胶颗粒凝集法。
2.原理 将梅毒螺旋体（Treponema pallidum）的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上，这种致敏粒子和标本中的梅毒螺旋体抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应（particle agglutination test），由此可以检测出血清和血浆中的梅毒螺旋体抗体。本实验可作为梅毒确证试验。
【仪器】
微量振荡器。
【试剂】
1.日本富士公司产品。
（1）A：复溶液，8. 0ml×1瓶。
（2）B：标本稀释液，29.0ml×1瓶。
（3）C：致敏粒子，0. 6ml×5瓶。
（4）D：未致敏粒子，0. 6ml×5瓶。
2.配套品 25μl滴管2支。
3.阳性质控品：效价1: 320，0.5ml×1瓶。
【操作步骤】
1.在微量反应板的第1孔加入标本稀释液100μl，从第2孔至第4孔每孔加25μl。
2.用微量加样器取标本25μl至第1孔中，然后以2n的方式从第1孔稀释至第4孔。
3.用滴管在第3孔中滴入1滴（25μl）未致敏粒子，在第4孔中滴入1滴（25μl）致敏粒子。
4.用微量振荡器混合30秒，加盖后于室温（15～30℃）下避光水平静置。2小时后观察结果。
5.结果判断
（1）阴性：粒子成纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。
（2）弱阳性：粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。
（3）阳性：粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地凝集在周围；或产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展。
【参考文献】
1.杨芳，邢文革.梅毒检测策略的应用现状.中国艾滋病性病，2009，15（5）:549-555
2.陈祥生.我国梅毒流行现状及防治策略.国际流行病学传染病学杂志，2008，35（2）:73-77
3.彭锐锐，李婧，陈祥生.梅毒螺旋体分子流行病学研究进展.中国艾滋病性病，2010，16（2）： 192-194
4.Centers for Disease Control and Prevention. Sexually Transmitted Disease Surveillance 2005 Supplement，Syphilis Surveillance Report［R］Atlanta，GA:US Department of Health and Human Services，Centers for Disease Control and Prevention，December 2006 1-24
【临床意义】
艾滋病，是人获得性免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）所致的一种严重传染病。通过检测血清或血浆中的HIV抗原或抗体可以证实HIV感染。HIV抗原仅在急性期感染和AIDS期才可以检测到。HIV抗体则可以在HIV感染以后很短的一段时间直到艾滋病阶段都可以检出。因此，高敏感性的HIV抗体+p24抗原联合检测，可以缩短窗口期，有利于早期诊断HIV感染，有效防止HIV病毒通过血液或血液制品传播。
【标本要求】
1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.保存血清或血浆分离后7天之内测定的标本可放置于2～8℃保存，超过7天在-20℃保存。
【方法与原理】
1.方法 酶联免疫一步夹心法。
2.原理 基于ELISA 一步法原理。以HIV抗原和HIV抗体的混合物标记辣根过氧化物酶（HRP）作为酶结合物，以四甲基联苯胺（TMB）和过氧化物作为底物。完成实验后，如果有颜色产生，提示存在HIV抗原或HIV抗体，如果没有颜色或只有非常浅的颜色，提示不存在HIV抗原或HIV抗体。
在酶标板孔内包备有特异性的成分：HIV-1 gp160、HIV-1 ANT70肽、HIV-2 env肽（氨基酸592-603）和抗-HIV-1 p24。在每个酶标板孔内同时包含有辣根过氧化物酶标记的相同的HIV抗原／抗体混合物的复合物。如果在样品中含有HIV-1或HIV-2抗体，将会形成固相抗原-抗体-酶标记抗原复合物。如果在样品中含有HIV-1抗原，将会形成固相抗体-抗原-酶标记抗体复合物。随加入TMB底物，如果在样品中存在HIV-1抗体，HIV-2抗体，HIV-10亚型抗体或HIV抗原，将会产生显色反应。相反，则在加入底物后不会显色。
【仪器】
酶标仪、洗板机和振荡器。
【试剂】
生产商：上海梅里埃生物工程有限公司。
试剂盒成分：
1.微量酶标板 每板12条，每条8孔。包被有HIV-lgp160、HIV-1ANT70、HIV-2 env（氨基酸592-603）和抗-HIV-1p24。
2.酶复合物 每个酶标板孔中有冻干珍珠状的酶复合物，为HRP标记HIV-1gp160、HIV-1 ANT70、HIV-2 env（氨基酸592-603）和抗HIV-1p24（鼠单抗）。
3.阴性对照 不含HIV抗原／抗体的人血清。
4.抗-HIV-1阳性对照 含有单克隆抗-HIV-1的人血清。
5.抗-HIV-2阳性对照 含有鼠单克隆抗-HIV-2的人血清。
6.HIV-1抗原阳性对照 HIV-1 p24（灭活）。
7.样品稀释液 含有蛋白稳定剂和去垢剂。
8.浓缩磷酸盐缓冲液 使用蒸馏水或去离子水进行25倍稀释。
9.TMB溶液 溶于枸橼酸的四甲基联苯胺。
10.尿过氧化物溶液。
【操作步骤】
1.按照所需数量在板架上放好酶标板条，撕去酶标板条上的封条。
2.所有孔加入100μl的样品稀释液，包括对照孔。
3.相应孔中加入50μl样品或质控对照。每一酶标板上要有3个阴性质控对照和1个抗- HIV-1阳性对照，如果有需要，加入抗-HIV-2阳性对照（50μl）和1个HIV-1抗原阳性对照（50μl）。
4.在未使用的酶标板孔内加入样品稀释液，用于溶解酶复合物球，以避免损坏洗板机。
5.振荡，［使用微板振荡器，15Hz，（900转／分钟，振荡15秒钟）］。
6.在（37±2）℃孵育（60±5）分钟。
7.用洗板机洗板6次（不完全的洗板会影响结果）。
8.每孔加入100μl TMB底物，不要振荡。
9.在（15～30）℃孵育（30±2）分钟。
10.加入100μl硫酸终止实验反应（按照加入底物的顺序和时间间隔）。保证充分混匀在15分钟内进行读数。
11.以空气读空白（不放板架和板条），在450nm（单波长）或450nm和620～700nm参考波长进行读数。
12.结果判定
（1）手工计算：每一块酶标板要单独进行计算。NC-阴性质控的吸光度值，PCl=抗HIV-1阳性质控吸光度值，PC2-抗HIV-2阳性质控吸光度值。
（2） NC值的要求：NC必须小于0.25；去掉大于等于0.25的阴性质控对照；计算小于0. 25的阴性质控平均值（NCx）；NC必须在0.6NCx和1.4NCx之间；去掉NC小于0.6NCx和大于1.4NCx的阴性质控对照。
（3）实验结果有效性须满足下列条件：
a）多于半数的阴性质控对照符合要求。
b） PCl-NCx≥0. 600。
c） PC2-NCx≥0.600（如果使用）。
d） PC3-NCx≥0.400（如果使用）。
（4）计算界限值：Cut off=NCx+0. 100
（5）样品OD值≥Cut off，判定为阳性反应。
（6）样品OD值＜Cut off，判定为阴性反应。
【性能参数】
1.敏感性 100%。
2.特异性 99. 9%。
【参考范围】
阴性。
【参考文献】
1.中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范.2009，9
2.张麒，佐拉，秦光明，等.评估第4代HIV酶联免疫法诊断试剂对静脉吸毒者感染窗口期的检测能力.中华检验医学杂志，2006，（07）
3.刘鱼，王憬惺，黄毅.HIV-1 P24抗原检测系统及应用研究进展.中国输血杂志，2009，（01）
4. Polywka S Puttmann H，I.ubben F，et al.A new combined HIV p24 antigen and ant，N- HIV-1／2/0 Screening assay. Methods Mol Biol，2005，304:229-243
5.许文燕，邱茏锋，佐台拉·吐尔地，等.第四代HIV抗原抗体酶联检测试剂缩短HIV检测 窗口期的研究.中华检验医学杂志，2007，30（3）：284-286
6.许四宏，李秀华，宋爱京，等.第四代HIV抗原抗体联合检测剂的评价.中国输血杂志， 2006，19（3）：188
【临床意义】
本试验定性检测血清和血浆中HIV-1和HIV-2抗体，适用于无偿献血员的现场初筛和临床紧急情况使用。初筛阳性时，需进一步做ELISA法检测。
【标本要求】
1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.标本量 静脉血2ml常规分离血清或血浆。
3.保存 分离后7天之内测定的血清或血浆标本可放置于2～8℃保存，超过7天在-20℃保存。
【方法与原理】
1.方法 胶体硒法。
2.原理 利用免疫层析原理，标本靠毛细作用移动通过结合物包被处，与硒胶体一抗原结合物混重组结合，继续迁移至检测区，如标本含HIV1／2抗体，被固相包被的合成肽和重组抗原所捕捉固定，形成一条红线；如标本中无HIV1／2抗体，则硒胶体-抗原结合物将会通过检测区，而没有红线。余下混合物继续移动至质控区形成红线。
【试剂】
雅培公司产品。
HIV1/2抗体胶体硒检测拭子条。
【操作步骤】
1.拆开每个测试条的外包装并编号，加50μl血清或血浆标本于标本反应垫中（箭头所指处），室温等待15～60分钟观察结果。结果判断：阳性结果为两条红线（患者窗口、质控窗口各一条）；阴性结果仅质控窗口一条红线；无效时无红线。
2.结果判断
（1）阴性：检测窗口无红线。
（2）阳性：检测窗口有红线。
（3）无论检测结果为阴性或阳性，标本都需使用ELISA法做进一步检测。
【参考文献】
1.中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范.2009，9
2.余育胜，王槐堂，郑曦.抗凝剂EDTA-K2对胶体硒免疫层析试验的影响.中国艾滋病性病， 2008，1
3.尚红.HIV检测及临床意义.齐鲁医学检验，2004，05
【临床意义】
解脲脲原体是正常人生殖道可以分离出的一种支原体。是不孕症、生殖道炎症等疾病近几年来常规检查项目之一。临床资料证明，解脲脲原体与不孕症、自然流产、死胎、女性生殖道炎症等威胁女性健康的疾病有一定的关系。资料显示，在女性常见的生殖道炎症中，解脲脲原体占非淋球菌阴道炎的67.6%；在宫颈炎和阴道炎病例中，解脲脲原体检出率为67%；在不育夫妇中，大约有90%的妇女感染了解脲脲原体，而正常女性仅22%可以检测出解脲脲原体。所以当不孕症患者查不出原因的时候，应检查解脲脲原体。解脲脲原体感染导致生殖道炎症，使黏膜细胞坏死，输卵管中的纤毛失去运动功能，受精卵运动受到抑制；解脲脲原体可直接吸附在精子的头部，破坏精子的活力，影响精子与卵子的正常结合，患者难以正常受精。解脲脲原体还与精子膜有共同抗原，一旦感染就有可能导致免疫性不孕。在不孕症中，解脲脲原体感染率在55. 2%～80%之间。孕妇一旦感染解脲脲原体，很容易发生低体重儿、新生儿呼吸道感染、胎儿死亡等严重后果。
【标本要求】
1.标本采集
（1）尿样标本：取清晨首次尿，或长时间（至少1小时）不排尿后的首段尿0. 5ml，与0.5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
（2）拭子标本：用医用棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口约1～2cm，旋转1周，停留10秒钟后取出后，将拭子头放入1ml生理盐水浸泡贴管壁挤干，取0. 5ml加入0.5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
2.保存 待测样本在2～8℃保存不应超过30天，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，应避免反复冻融。
3.运输 密封冷藏（2～8℃）运输。
【方法与原理】
本试剂盒的解脲脲原体核酸检测分为核酸提取和恒温扩增检测。
在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸（RNA）。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Tes-ting，SAT）使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从双链DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照、阴性对照和界值参考品对检验结果进行判定。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）、磁力架、电动吸引器。
【试剂】
上海仁度生物科技有限公司解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
试剂组成：

组成成分
包装盖颜色
规格
尿样保存液
核酸提取液
洗涤液
UU反应液
UU检测液
SAT酶液
UU阳性对照
UU阴性对照
白
白
白
黄
棕
紫
红
绿
1×10ml
2×1ml
1×40ml
1×800μl
1×50μl
1×200μl
1×50μl
1×50μl

（1）尿样保存液：含去垢剂，用于保存细菌RNA。
（2）核酸提取液：含捕获探针和磁性颗粒，用于结合病原体RNA。
（3）洗涤液：含SDS。
（4） UU反应液：含dNTPs、NTPs和扩增所需组分。
（5） UU检测液：含UU特异引物、特异荧光探针。
（6） SAT酶液：含逆转录酶，T7聚合酶。
（7） UU阳性对照：含UU RNA。
（8） UU阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。
【操作步骤】
1.试剂准备按照每人份40μl反应液+2.5μl检测液配制扩增检测液，混匀备用。
2.核酸提取
（1）取400μl已加好尿样保存液的标本（阴阳对照的做法是200μl生理盐水+200μl尿样保存液+10μl对照），加入100μl核酸提取液。震荡，60℃温浴5分钟，再室温放置10分钟。
（2）将其放在磁力架上，吸附磁珠5分钟。待磁珠吸附到管壁一侧后，用真空泵吸走废液。然后加入1ml洗涤液，震荡混匀，继续吸附。吸附好后，再次吸走废液。再重复洗涤一次。
（3）最后一次要尽量吸干净废液，然后向其中加入步骤1中配好的扩增检测液40μl，震荡，让磁珠悬浮其中。然后转移30μl到微量反应管中。60℃温浴10分钟，然后再42℃温浴5分钟。然后每孔加入42℃预热好的SAT酶10μl。
3.上机扩增提前打开核酸扩增仪并设置扩增程序（42℃，40分钟，每分钟采一次荧光，选取FAM通道）。加好酶后要马上放入核酸扩增仪进行扩增。
4.质量控制 （1）应用临界弱阳性对照进行实验室质控：为了防止出现漏检（假阴性）的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
a）临界弱阳性对照的制备：取生理盐水和尿样保存液按照1:1混合作为稀释液，将试剂盒提供的阳性对照（2000CFU/反应）稀释40倍即为临界弱阳性对照（50CFU/反应）。
b）临界弱阳性对照的使用方法：取0.2ml生理盐水加入0.2ml尿样保存液中，混匀后加入10μl临界弱阳性对照，混匀备用；样本处理和检测过程同阳性对照和阴性对照。
（2）实验质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的检测时间（detection time，dt）值应满足以下条件：界值参考品的dt在10≤dt≤20；阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40；否则，实验视为无效需重新进行。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）。
5.结果判定
（1）阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
（2）结果判断
a） dt≤35的样本为阳性（UU菌携带者）。
b）dt≤界值参考品的dt值，表明样本中UU菌总数≥104 CFU／ml，需要进行临床干预治疗。
c） 35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性；dt无数值或为40的样本为阴性。
注：①dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）。
②界值参考品的dt在10≤dt≤20，这是一个参考范围，每个实验室应根据具体的仪器环境，建立自己的dt范围。
【参考范围】
通过对界值参考品浓度UU培养物进行大量实验统计分析，确定其99%置信区间的dt值范围为：10≤dt≤20；通过对检测下限浓度UU培养物大量实验统计分析，并结合健康体检者样品和阳性样品的实验数据，确定95%置信区间为：dt≤35，99%置信区间的dt值范围为：dt＜40。
【临床意义】
淋病（gonorrhea）是淋菌性尿道炎的简称，是由淋球菌引起的泌尿生殖系统化脓性炎性疾病，主要通过性传播。该病致病病原体是淋病奈瑟菌，又称淋病双球菌、淋球菌、淋菌，是奈瑟于1879年首先发现的。30年来，无症状带菌者的增多（女性患者高达75%）、避孕方法的改变（避孕药取代了子宫帽、避孕套）以及耐药菌株的不断出现，更加快了本病的传播。在许多国家和地区，淋病的患病率一直居于各种性传播疾病的首位。本病最初多侵犯尿道、宫颈内膜，继而可波及前列腺、精囊、附睾、子宫内膜及输卵管。有时肛门、直肠、咽黏膜、眼结膜也可受染。尚可经血行播散引起菌血症、关节炎、心内膜炎及脑膜炎，可引起死亡或不育、不孕、失明及尿道狭窄等后果。由于本病潜伏期短、传染性强、后果严重，因此它是我国当前重点防治的性病之一。淋病的好发年龄为性活跃的中青年，但可发生于任何年龄。一般分为单纯性淋病、有并发症淋病和播散性淋病。
【标本要求】
1.标本采集
（1）尿样标本：取清晨首次尿，或长时间（至少1小时）不排尿后的首段尿0. 5ml，与0.5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
（2）拭子标本：将医用棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口约1～2cm，旋转1周，停留10秒钟后取出放入1ml生理盐水浸泡贴管壁挤干，取0.5ml加入0. 5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
2.保存待测样本在2～8℃保存不应超过30天，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，应避免反复冻融。
3.运输密封冷藏（2～8℃）运输。
【方法与原理】
本试剂盒的淋球菌核酸检测分为核酸提取和恒温扩增检测。
在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸（RNA）。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Tes-ting，SAT）使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从双链DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照和阴性对照对检验结果进行判定。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）、磁力架、电动吸引器。
【试剂】
上海仁度生物科技有限公司淋病奈瑟菌（NG）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
试剂组成：

组成成分
包装盖颜色
规格
尿样保存液
核酸提取液
洗涤液
NG反应液
NG检测液
SAT酶液
NG阳性对照
NG阴性对照
白
白
白
黄
棕
紫
红
绿
1×10ml
2×1ml
1×40ml
1×800μl
1×50μl
1×200μl
1×50μl
1×50μl

（1）尿样保存液：含去垢剂，用于保存细菌RNA。
（2）核酸提取液：含捕获探针和磁性颗粒，用于结合病原体RNA。
（3）洗涤液：含SDS。
（4）NG反应液：含dNTPs、NTPs和扩增所需组分。
（5）NG检测液：含NG特异引物、特异荧光探针。
（6）SAT酶液：含逆转录酶，T7聚合酶。
（7） NG阳性对照：含UNGRNA。
（8） NG阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。
【操作步骤】
1.试剂准备 按照每人份40μl反应液+2.5μl检测液配制扩增检测液，混匀备用。
2.核酸提取
（1）取400μl已加好尿样保存液的标本（阴阳对照的做法是200μl生理盐水+200μl尿样保存液+10μl对照），加入100μl核酸提取液。震荡，60℃温浴5分钟，再室温放置10分钟。
（2）将其放在磁力架上，吸附磁珠5分钟。待磁珠吸附到管壁一侧后，用真空泵吸走废液。然后加入1ml洗涤液，震荡混匀，继续吸附。吸附好后，再次吸走废液。再重复洗涤一次。
（3）最后一次要尽量吸干净废液，然后向其中加入步骤1中配好的扩增检测液40μl，震荡，让磁珠悬浮其中。然后转移30μl到微量反应管中。60℃温浴10分钟，然后再42℃温浴5分钟。然后每孔加入42℃预热好的SAT酶10μl。
3.上机扩增 提前打开核酸扩增仪并设置扩增程序（42℃，40分钟，每分钟采一次荧光，选取FAM通道）。加好酶后要马上放入核酸扩增仪进行扩增。
4.质量控制
（1）应用临界弱阳性对照进行实验室质控：为了防止出现漏检（假阴性）的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
a）临界弱阳对照的制备：取生理盐水和尿样保存液按照1：1混合作为稀释液，将试剂盒提供阳性对照品（105 copies/反应）稀释100μl倍即为临界弱阳性对照（103 copies/反应）。
b）临界弱阳性对照的使用方法：取0. 2ml生理盐水加入0.2ml尿样保存液中，混匀后加入10μl临界弱阳性对照，混匀备用；样本处理和检测过程同阳性对照和阴性对照。
（2）实验质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的检测时间（detection time，dt）值应满足以下条件：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40；否则，实验视为无效，需重新进行。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的Ct值类似）。
5.结果判定
（1）阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
（2）结果判断
a） dt≤35的样本为阳性。
b） 35＜dt＜40的样本建议重新检测，再次检测结果dt＜40的样本为阳性。
c） dt无数值或为40的样本为阴性。
【参考范围】
通过对检测下限浓度RNA大量实验统计分析，并结合体检者样品和阳性样品的实验数据，确定95%覆盖下dt≤35；99%覆盖下dt＜40。
【临床意义】
HCMV通常由口腔、生殖道、胎盘、输血或器官移植等多途径传播。人对HCMV普遍易感。HCMV主要引起机会性感染。胎儿期和新生儿容易发生HCMV的显性感染。化疗和放疗的肿瘤患者、器官移植、自身免疫病患者以及艾滋病患者极易通过感染而发病。HCMV还在人类动脉粥样硬化中起关键作用。由于免疫功能低下也可使机体潜伏状态的病毒激活而发病。
人巨细胞病毒DNA检测，敏感性强，利于早期诊断。检测HCMV DNA有助于诊断是否HCMV感染引起疾病加重；通过监测病毒活跃程度，可以观察抗病毒治疗的效果。
HCMV DNA水平检测更适于应用在AIDS的活动性HCMV感染的监测以及血液白细胞过少难于进行PP65检测的标本，并且可对尿液、乳汁等标本检测。
【标本要求】
1.种类尿液、乳汁、血清或淋巴细胞。
2.标本取样量及保存方法
（1）尿液、乳汁：取晨尿或成熟乳3～5ml于无菌的干燥玻璃管中，密闭送检。
（2）血清、血浆：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的血清或EDTA抗凝的血浆采血管中，使用水平离心机，2000转／分钟离心10分钟；吸取上清至1. 5ml灭菌离心管中。
（3）全血（淋巴细胞）：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的采血管中，立即轻轻颠倒采血管，混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。全血标本可立即用于测试，也可保存于4℃待测，保存期为24小时。
（4）标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测（全血经分离后，保存其血浆或血清），保存期为6个月。标本运送采用O℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法实时荧光定量PCR检测法。
2.原理选取人巨细胞病毒株（即人疱疹病毒5型）-AD169基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一高度保守的非编码区为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针，扩增片段长度为86bp，利用实时荧光定量PCR技术，定量检测尿液、乳汁、血清、血浆或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒DNA。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司人巨细胞病毒（HCMV）核酸扩增荧光定量检测试剂盒

组分名称
规格
数量
DNA浓缩液
DNA提取液
HCMVPCR反应液
Taq酶
阴性质控品
HCMV弱阳性质控品
HCMV强阳性质控品
HCMV阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）红色
HCMV阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）黄色
HCMV阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）蓝色
HCMV阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）绿色
2000μl／管
500μl／管
400μl管
60μl／管
50μl／管
200μl／管
200μl／管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性质控品处理：取出阴性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（2）标本处理
1）乳汁（尿液处理同乳汁）
摇匀乳汁，取1～1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟；
去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12 000转／分钟离心5分钟；
去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；
12 000转／分钟离心10分钟，备用。
2）血清、血浆
取100μl血清或血浆加入等量DNA浓缩液充分混匀，12 000转／分钟离心10分钟；
去上清，沉淀中加入20μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；
12 000转／分钟离心10分钟，备用。
3）全血
取全血1ml至干燥无菌试管中，加入生理盐水1ml轻摇混匀；
取干燥无菌试管加入500～700μl淋巴细胞分离液；
将稀释好的全血用加样枪缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿着管壁，速度要慢）；1500转／分钟离心20分钟（建议用水平离心机）；
吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1. 5ml离心管，12 000转／分钟离心5分钟；
去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心10分钟，备用。
（3） HCMV弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（4） HCMV强阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（5） HCMV阳性定量参考品处理：震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（HCMV PCR反应液40μl／人份+Taq酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42.5μl／管分装至LightCy-cler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2. 5μl，直接加入阳性定量参考品2. 5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：HCMV反应程序93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针。选择Abs Quant/Fit Ppoint分析模式，Error＜0.2；efficiency:l. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品；增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在1.0×105～2.0×106基因拷贝／ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在1.0×103～2.0×104基因拷贝/ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1或r2≥0. 985。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的HCMV DNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
a）若样品的浓度＜5.0×102基因拷贝／ml，全血、乳汁、尿液样品HCMVDNA总含量＜5.0×102基因拷贝／ml，血清样品HCMV DNA总含量＜2.0×103基因拷贝／ml需重新检测。
b）若样品的浓度5.0×102≤C≤5.0×108基因拷贝/ml，全血、乳汁、尿液样品HCMV DNA总含量=C基因拷贝／rnl，血清样品HCMV DNA总含量=4.0×C基因拷贝/ml。
c）若样品的C＞5. 00E+008，则全血、乳汁、尿液样品HCMV DNA总含量＞5.0×108基因拷贝/ml，血清样品HCMV DNA总含量＞2.0×109基因拷贝／ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品
1.灵敏度为5.0×102基因拷贝/ml。
2.线性范围为5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。
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【医技】检验科医疗诊疗规——第三篇 临床微生物检验111-121

作者:王泓  日期:2014-06-19

【临床意义】
柯萨奇病毒A16型（CA16）感染可导致手足口病，为手足口病的主要病原体。也可引起疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿等症状或并发症，严重者可导致死亡。人是肠道病毒唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源。肠道病毒主要经粪-口和（或）呼吸道飞沫传播，亦可经接触患者皮肤、黏膜泡疹液而感染。采用实时荧光RT-PCR方法，对粪便、咽拭子、疱疹液样本中的CA16核酸进行定性检测可对CA16感染的诊断有重要的参考价值。有助于临床有针对性地采取治疗措施，使患者的病情尽快好转。柯萨奇病毒核酸测定，也可对其感染患者进行药物治疗的疗效监控。及早治疗，预防传播。
方法1：达安基因柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸扩增荧光检测试剂盒
【标本要求】
1.种类粪便、咽拭子、疱疹液等。
2.标本取样量及保存方法样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。
（1）粪便样本：采集患者发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量每份5～8g，采集后立即放入无菌采便管内。
（2）咽拭子样本：采集患者发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
（3）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份样本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
（4）标本保存和运送：样本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为4个月；长期保存，请置于-70℃；临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，样本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。
【方法与原理】
1.方法 荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，以CA16基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增对CA16 RNA进行定性检测。临床样本使用商业化核酸提取试剂进行RNA提取后，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配制成PCR反应管。将核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT值）实现对未知样本的定性检测。 【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸扩增荧光检测试剂盒

组分名称
规格
数量
CA16RT-PCR反应液
逆转录酶系
Taq酶系
阴性质控品
CA16强阳性质控品
360μl／管
50μl／管
75μl/管
300μl管
300μl/管
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.RNA提取 建议取200μl液态样本进行核酸提取。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸柱提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的阴性、阳性质控品均参与提取，分别用于对环境监控和PCR检测试剂的质控。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（CA16 RT-PCR反应液15μl／人份十逆转录酶系2μl／人份+Taq酶系3μl／人份）取相应量的RT-PCR反应液、逆转录酶系及Taq酶系，充分混匀后按20μl／管分装至LightCycler4 80Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、阳性质控品）上清液5μl，3000转／分钟离心30秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择CA16的程序，点击窗口右下角的 ，核对CA16反应程序（400C 25分钟；94℃3分钟；93℃2分钟；93℃15秒→55℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Tem-plate”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择未知标本、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图；再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
 
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且阳性质控品Ct＜30。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果检测样本无典型S形扩增曲线或Ct值＞34.8，则判样本为CA16阴性。
（2）如果检测样本呈典型S形扩增曲线且Ct值≤34.8，则判样本为CA16阳性。
【参考范围】
通过临床试验结果分析，利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的参考范围为Ct值等于35.1。试剂盒灵敏度：使用CCID50标定法为1.0×10z CCID50/0.1ml；使用空斑计数法为1.0×103 PFU／ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒（肠道病毒71型、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒等）无交叉反应。
方法2：上海之江CA16配套试剂
【标本要求】
1.种类咽拭子、粪便、疱疹液、血清和血浆（枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.标本取样量及保存方法样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。
（1）粪便样本：采集患者发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量每份5～8g，采集后立即放入无菌采便管内。
（2）咽拭子样本：采集患者发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
（3）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份样本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
（4）静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.标本保存和运送样本可立即用于测试，含生理盐水的拭子可2～8℃保存24小时，也可保存于-20℃待测，保存期为4个月。长期保存，请置于-70℃。临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，样本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。
【方法与原理】
1.方法 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）
2.原理 用特异性RNA核酸片段进行体外逆转录和扩增的荧光PCR检测过程。
（1）分析范围：1000～108 copies／ml。
（2）干扰因素：标本的溶血，留取时污染。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
上海之江公司CA16配套试剂。
1.试剂包组成：
（1） CA16荧光PCR检测混合液。
（2）RT-PCR酶。
（3） DEPC-H2O。
（4）阳性对照品。
2.其他试剂及耗材
（1） Trizol。
（2）氯仿。
（3）异丙醇。
（4）75%乙醇。
3.质控品 H2O检测显示UNDET（ABI荧光定量PCR仪）。
4.校准品。
【操作步骤】
1.标本和内部对照品的核酸裂解处理用Trizol法提取，取100μl样本置于1. 5ml离心管中，加300μl裂解液（Trizol），再加100μl氯仿，振荡器上震荡混匀5秒，13 000转／分钟离心15分钟，取上层液体加等体积的异丙醇，颠倒混匀室温静置10分钟，13 000转／分钟离心10分钟，轻轻倒去上清，加700μl的75%乙醇，颠倒洗涤，13 000转／分钟离心5分钟，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上。弃尽液体后，加20μl DEPC-H2O溶解RNA。
2.试剂配制 取N×19μl CA16荧光PCR检测混合液与N×1μl RT-PCR酶（N为反应管数），震荡混匀数秒，3000转／分钟离心数秒。
3.加样 取上述混合液20μl置薄壁PCR管或PCR反应板中，然后将标本、阴性对照品、内部阳性对照品的处理上清各5μl加入薄壁PCR管或PCR反应板中，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，立即进行PCR扩增反应。
4.PCR扩增 反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数设置：45℃×10分钟；95℃×5分钟；循环一次，95℃×15秒→60℃×60秒，循环40次。余同达安PCR扩增。
5.基线和阈值设定 基线调整取5～15个循环的荧光信号，阈值设置刚好超过阴性对照品的最高点。
【参考范围】
阴性。
【临床意义】
EB病毒（EBV）感染呈全球性，我国80%～90%成人感染过EBV。儿童原发性感染几乎没有症状，但大多数青壮年感染呈传染性单核细胞增多症（infec-tious mononucleosis，IM）表现。其主要症状为发热、咽喉痛、淋巴结肿大和血清转氨酶升高。但在对于使用免疫抑制患者可能是致死性的原因之一。EBV与一些肿瘤有密切的病因学关系，如非洲儿童恶性淋巴瘤（Burkitt淋巴瘤）及鼻咽癌以及霍奇金淋巴瘤、免疫缺陷患者B细胞淋巴瘤、艾滋病中枢神经系统淋巴瘤及接受同种异体移植者的鼻咽部T细胞淋巴瘤等。
唾液传播是主要方式，也可通过空气和血液传播。EBV的检测临床意义越来越大。血清学的检测受个体差异影响较大。EBV核酸检测由于敏感性高，在EBV感染及其相关疾病的诊断中发挥重要的作用，也是对其他检测系统的补充，可以做到早期辅助诊断，最大限度地避免漏检。有助于临床有针对性地采取治疗措施，使患者的病情尽快好转。及早治疗，预防传播。EBV核酸检测也可对其感染患者进行药物治疗的疗效监控。
【方法与原理】
1.方法实时荧光定量PCR检测法。
2.原理用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒（EBV） DNA。
【标本要求】
1.种类全血（淋巴细胞）。
2.标本取样量及保存方法全血（淋巴细胞）用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含乙二胺四乙酸二钠（EDTA）或枸橼酸钠抗凝剂的采血管，立即轻轻颠倒采血管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测（全血除外），保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司：EB病毒核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒

组分名称
规格
数量
DNA提取液
EBPCR反应液
Taq酶
阴性质控品
EB弱阳性质控品
500μl／管
400μl／管
60μl/管
150μl／管
200μl/管
2
2
1
1
1

续表

组分名称
规格
数量
EB强阳性质控品
EB阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝／ml）红色
EB阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝／ml）黄色
EB阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝／ml）蓝色
EB阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝／ml）绿色
200μl／管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性质控品处理：取出阴性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（2）标本处理
1）取全血1ml至干燥无菌试管中，加入生理盐水1ml轻摇混匀。
2）取干燥无菌试管加入500～700μl淋巴细胞分离液。
3）将稀释好的全血用加样器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿着管壁，速度要慢），1500转／分钟，离心20分钟（建议用水平离心机）。
4）吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1. 5ml离心管，12 000转／分钟离心5分钟。
5）去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
6）12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（3） EB弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（4） EB强阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（5）EB阳性定量参考品处理震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（EB PCR反应液40μI／人份+Taq酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42.5μl／管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2. 5μl，直接加入阳性定量参考品2. 5μl 8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：EB反应程序（93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针。
（4）结果分析：选择Abs Quant/Fit point分析模式，在窗口中的Subset（第二行）选择本次实验的子集。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在6. 310×106～1. 000×108基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在6. 310×103～1. 000×105基因拷贝／ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的EB DNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
1）若样品的C＜5. 00E+003，全血样品EB DNA总含量＜5.0×103基因拷贝／ml；
2）若样品的5.00E+003≤C≤5.00E+007，全血样品EB DNA=C基因拷贝/ml；
3）若样品的C＞5.00E+007，全血EB DNA总含量＞5.0×107基因拷贝/ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品的灵敏度为5.0×103基因拷贝／ml，线性范围为5.0×103～5.0×107基因拷贝／ml。
【临床意义】
EV71感染与Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。人是肠道病毒唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源。肠道病毒主要经粪一口和（或）呼吸道飞沫传播，亦可经接触患者皮肤、黏膜泡疹液而感染。目前已知EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎，甚至致死性肺水肿。可伴有严重的CNS并发症，无菌性脑膜炎等多种与神经系统相关的疾病。严重者可导致死亡。采用实时荧光RT-PCR方法，对粪便、咽拭子、疱疹液、血液样本中的EV71核酸进行定性检测，可对EV71感染提供病原学诊断依据，并对此病毒感染治疗进行疗效监测。
检验方法1：上海之江EV71配套试剂
【标本要求】
1.种类咽拭子、粪便、疱疹液、血清（枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.标本取样量及保存方法样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。
（1）粪便样本：采集患者发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量每份5～8g，采集后立即放入无菌采便管内。
（2）咽拭子样本：采集患者发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
（3）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份样本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
（4）静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.标本保存和运送样本可立即用于测试，含生理盐水的拭子可2～8℃保存24小时，也可保存于- 20℃待测，保存期为4个月。长期保存，请置于-70℃。临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，样本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。
【方法与原理】
1.方法 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）。
2.原理用特异性RNA核酸片段进行体外逆转录和扩增的荧光PCR检测过程。
（1）分析范围：1000～108 copies／ml。
（2）干扰因素：标本的溶血。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
上海之江公司EV71配套试剂。
1.试剂包组成（不可拆分） EV71荧光PCR检测混合液；RT-PCR酶；DEPC-H2O；阳性对照品。
2.其他试剂及耗材 ①Trizol；②氯仿；③异丙醇；④75%乙醇。
3.质控品 H2O检测显示UNDET（ABI荧光定量PCR仪）。
4.校准品。
【操作步骤】
1.标本和内部对照品的核酸裂解处理用Trizol法提取：取100μl样本置于1. 5ml离心管中，加300μl裂解液（Trizol），再加100μl氯仿，振荡器上震荡混匀5秒，13 000转／分钟离心15分钟，取上层液体加等体积的异丙醇，颠倒混匀室温静置10分钟，13 000转／分钟离心10分钟，轻轻倒去上清，加700μl的75%乙醇，颠倒洗涤，13 000转／分钟离心5分钟，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上。弃尽液体后，加20μl DEPC-H2O溶解RNA。
2.试剂配制 取N×19μl EV71荧光PCR检测混合液与N×1μl RT-PCR酶（N为反应管数），震荡混匀数秒，3000转／分钟离心数秒。
3.加样 取上述混合液20μl置薄壁PCR管或PCR反应板中，然后将标本，阴性对照品，内部阳性对照品的处理上清各5μl加入薄壁PCR管或PCR反应板中，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，立即进行PCR扩增反应。
4.PCR扩增反应管置于定量荧光PCR仪上，循环参数设置：45℃×10分钟；95℃×5分钟；循环一次，95℃×15秒→60℃×60秒，循环40次。
5.基线和阈值设定基线调整取5～15个循环的荧光信号，阈值设置刚好超过阴性对照品的最高点。Ct值在35附近为弱阳性结果。Ct值大于38建议重复检测一次。
检验方法2：达安基因肠道病毒71型（EV71）核酸扩增荧光检测试剂盒
【标本要求】
同上海之江公司试剂盒，但不适用于血清标本。
【方法与原理】
1.方法 荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，以EV71基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增对EV71 RNA进行定性检测。临床样本使用商业化核酸提取试剂进行RNA提取后，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配制成PCR反应管。将核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（Ct值）实现对未知样本的定性检测。
【仪器】
高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司肠道病毒71型（EV71）核酸扩增荧光检测试剂盒
试剂盒组成（不可拆分）：

组分名称
规格
数量
EV71RT-PCR反应液
逆转录酶系
Taq酶系
阴性质控品
EV71强阳性质控品
360μl/管
50μl/管
75μl／管
300μl／管
300μl/管
1
1
1
1
1

【操作程序】
1.RNA提取 建议取200μl液态样本进行核酸提取。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸柱提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的阴性、阳性质控品均参与提取，分别用于对环境监控和PCR检测试剂的质控。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（EV71 RT-PCR反应液15μl/人份十逆转录酶系2μl／人份+Tag酶系3μl/人份）取相应量的RT-PCR反应液、逆转录酶系及Taq酶系，充分混匀后按20μI/管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、阳性质控品）上清液5μl，3000转／分钟离心30秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择EV71的程序，点击窗口右下角的 ，核对EV71反应程序（40℃25分钟；94℃3分钟；93℃2分钟；93℃15秒→55℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Tar-gets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Pro-grams”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择未知标本、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs QuantlFit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图；再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Effi-ciency:1. 8～2.1为有效。
 
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且阳性质控品Ct＜30。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果检测样本无典型S形扩增曲线或Ct值＞35.1，则判样本为EV71阴性。
（2）如果检测样本呈典型S形扩增曲线且Ct值≤35.1，则判样本为EV71阳性。
通过临床试验结果分析，利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的参考范围为Ct值等于35.1。试剂盒灵敏度：使用CCID50标定法为1.0×102 CCID50/0.1ml；使用空斑计数法为1.0×103 PFU／ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒（柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒等）无交叉反应。
【参考范围】
阴性。
【临床意义】
检测漱口水、胃液或胃黏膜组织等样本中幽门螺旋杆菌（Hp） DNA，可用于胃及十二指肠溃疡或炎症、胃癌的病原学鉴别诊断，药物治疗效果的评估。
【标本要求】
1.种类漱口水、胃液、胃黏膜组织等。
2.标本取样量及保存方法
（1）漱口水、胃液：取漱口水或胃液1～5ml于无菌的干燥玻璃管中，密封送检。
（2）胃黏膜组织：取胃窦部黏膜组织适量，置无菌玻璃管，密闭送检。
（3）标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法实时荧光定量PCR检测法。
2.原理用一对幽门螺旋杆菌（Hp）特异性引物和一条幽门螺旋杆菌（Hp）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测幽门螺旋杆菌（Hp） DNA。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司幽门螺旋杆菌（Hp）核酸扩增荧光定量检测试剂盒

组分名称
规格
数量
DNA提取液
HpPCR反应液
Taq酶
500μl／管
400μl／管
60μl／管
2
2
1

续表

组分名称
规格
数量
阴性质控品
Hp弱阳性质控品
Hp强阳性质控品
Hp阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）红色
Hp阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）黄色
Hp阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝／ml）蓝色
Hp阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）绿色
150μl／管
200μl／管
200μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
1
1
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性、阳性质控品处理：取出阴性、阳性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（2）标本处理
漱口水（漱口水和胃液标本处理相同）
①摇匀漱口水，取1～1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
②去上清，沉淀（沉淀如不明显，可重复前两步骤一遍）加灭菌生理盐水1ml混匀，12 000转／分钟离心5分钟。
③去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
④12 000转／分钟离心5分钟，备用。
胃黏膜组织
①用适量灭菌生理盐水清洗送检组织沾带的血液。
②取约50mg组织，加1ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
③去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
④12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（3） Hp阳性定量参考品处理：震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（Hp PCR反应液40μl／人份+Tag酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42.5 μl／管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2. 5μl，直接加入阳性定量参考品2.5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择Hp的程序，点击窗口右下角的 ，核对Hp反应程序（93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Tar-gets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“ApplyTemplate”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Tem-plates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在 左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。
 
再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的
，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在1.0×106～2.0×107基因拷贝／ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在2.0×102～2.0×104基因拷贝／ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1或r2≥0. 985。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的Hp DNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
a）若样品的C＜5.0×102基因拷贝／ml，则漱口水、胃液样品的Hp DNA总含量＜5.0×102基因拷贝/ml，组织的HpDNA含量＜5.0×102基因拷贝。
b）若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，则漱口水、胃液样品的HpDNA总含量=C基因拷贝／ml，组织的Hp DNA含量=C基因拷贝。
c）若样品的C＞5. 00E+008，则漱口水、胃液样品的Hp DNA总含量为＞5.0×108基因拷贝／ml，组织的Hp DNA含量＞5.0×108基因拷贝。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品的灵敏度为5.0×102基因拷贝／ml，线性范围为5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。
【临床意义】
HSV-2则是生殖器疱疹的主要病原体（90%），存在于皮肤和黏膜损害的渗出液、精液、前列腺分泌液、宫颈和阴道分泌液中，主要通过性交传染，引起原发性生殖器疱疹。原发性生殖器疱疹消退后，残存的病毒经周围神经沿神经轴长期潜存于骶神经节，当机体抵抗力降低或某些激发因素如发热、受凉、感染、月经、胃肠功能紊乱、创伤等作用下，可使体内潜伏的病毒激活而复发。检测生殖泌尿道分泌物、生殖道刮片等样本受感染细胞中单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型DNA，对诊断是否有该病毒的感染有重要的参考价值。可用于单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型感染患者药物治疗的疗效监控。
【标本要求】
1.种类生殖泌尿道分泌物棉拭子、尿道口或患病部位刮片等。
2.标本取样量及保存方法
（1）男性生殖泌尿道分泌物棉拭子：用细小无菌无病毒的棉拭子伸入尿道约2～4cm，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌管中，密闭送检（采集分泌物前2小时禁小便）。
（2）女性生殖道分泌物棉拭子：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭子采集宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌管中，密闭送检。
（3）女性尿道分泌物棉拭子：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2cm，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。
（4）尿道口或患病部位刮片：用刮片刮取宫颈病灶处脱落细胞，置入无菌管中，密闭送检。
（5）标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法 实时荧光定量PCR检测法。
2.原理 用一对单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型特异性引物和一条单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型DNA。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型（HSVⅡ）核酸扩增荧光定量检

组分名称
规格
数量
DNA提取液
HSVⅡPCR反应液
Taq酶
500μl／管
400μl管
60μl／管
2
2
1

续表

组分名称
规格
数量
阴性质控品
HSVⅡ弱阳性质控品
HSVⅡ强阳性质控品
HSVⅡ阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）红色
HSVⅡ阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝／ml）黄色
HSVⅡ阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）蓝色
HSVⅡ阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）绿色
150μl／管
200μl／管
200μl／管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
1
1
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性质控品处理。
（2）取出阴性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（3）标本处理
1）生殖泌尿道分泌物棉拭子
①向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子。
②吸取全部液体转至1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
③去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12 000转／分钟离心5分钟。
④去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
⑤12 000转／分钟离心5分钟，备用。
2）尿道口或患病部位刮片：向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀；
以下处理同上。
（4） HSVⅡ弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（5） HSVⅡ强阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（6） HSVⅡ阳性定量参考品处理震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（HSVⅡPCR反应液40μl／人份+Taq酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42.5μl/管分装至LightCy-cler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2.5μl，直接加入阳性定量参考品2.5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择HSVⅡ的程序，点击窗口右下角的 ，核对HSVⅡ反应程序（93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experi-ment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Tem-perature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在NoiseBand中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。再点击进入 ，点击软件界面中间偏右能 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
 
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在1.0×106～2.0×107基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在2.0×102～2.0×104基因拷贝/ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1或r2≥0. 985。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的HSVⅡDNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
a）若样品的C＜5. 00E+002，样品HSVⅡDNA总含量＜5.0×102基因拷贝／ml。
b）若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，样品HSVⅡDNA总含量一C基因拷贝/ml。
c）若样品的C＞5. 00E+008，样品HSVⅡDNA总含量＞5.0×108基因拷贝／ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品的灵敏度为5.0×102基因拷贝/ml，线性范围为5.0×102～5.0×108基因拷贝／ml。主要高危型HPV与本试剂盒无交叉反应。
【临床意义】
肺炎支原体（Mycoplasma pneumomae，MP）是通过飞沫及经人传入传播，引起呼吸道感染的一种病原体，主要引起间质性肺炎（非典型性肺炎）哮喘及支气管炎。也可引起肺外并发症，如脑膜炎、脑干炎、脊髓炎、心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等。多发夏秋季节。肺炎支原体是目前成人和儿童呼吸道感染的主要病原体之一，而且其感染率有逐年上升的趋势。支原体有很强的传染性，可引起散发或小范围内流行，常引起集体感染，例如幼儿园、学校、社区等。也常常在家庭成员中交叉传染，导致久治不愈。
肺炎支原体核酸检测由于敏感性高，对诊断肺炎支原体感染有很重要的参考价值，也是对其他检测系统的补充，可以做到早期辅助诊断，最大限度地避免漏检。有助于临床有针对性地采取治疗措施，使患者的病情尽快好转。及早治疗，预防传播。肺炎支原体核酸检测也可对其感染患者进行药物治疗的疗效监控。
【标本要求】
1.种类痰液、肺及支气管灌洗液、咽拭子等。
2.标本取样量及保存方法
（1）痰液——用无菌5ml玻璃管取受检者肺深部咳出痰液1～3ml，密封送检；婴幼儿用密闭容器与无菌吸痰器相连，吸取痰液，密封送检。
（2）肺及支气管灌洗液——用无菌5ml玻璃管收集灌洗液1～3ml，密封送检。
（3）咽拭子——用棉拭子取咽部分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密封送检。
（4）标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法 实时荧光定量PCR检测法。
2.原理 用一对肺炎支原体（MP）特异性引物和一条肺炎支原体（MP）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法定量检测肺炎支原体（MP） DNA。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司肺炎支原体（MP）核酸扩增荧光定量检测试剂盒

组分名称
规格
数量
DNA提取液
MPPCR反应液
Taq酶
阴性质控品
MP弱阳性质控品
MP强阳性质控品
MP阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）红色
MP阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝／ml）黄色
MP阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝／ml）蓝色
MP阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝／ml）绿色
500μl/管
400μl／管
60μl／管
50μl／管
50μl／管
50μl／管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性质控品处理。
（2）取出阴性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（3）标本处理
1）痰液
①痰液中加入4倍体积的生理盐水，轻轻震荡后置4℃冰箱过夜。
②用吸头或吸管混匀后吸取1～1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
③去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
④12 000转／分钟离心5分钟，备用。
2）肺及支气管灌洗液
①取灌洗液1. 0～1. 5ml离心管，12，000转／分钟离心5分钟。
②去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12 000转／分钟，离心5分钟。
③去上清，以下处理同上。
3）咽拭子
①向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子。
②吸取全部液体转至1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
（4） MP弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（5）MP强阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（6） MP阳性定量参考品处理震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（MP PCR反应液40μl／人份+Taq酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42. 5μl/管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2. 5μl，直接加入阳性定量参考品2. 5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择MP的程序，点击窗口右下角的 ，核对MP反应程序（93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Tar-gets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Tem-plates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在1.0×106～2.0×107基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在2.0×102 ～2.0×104 基因拷贝/ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1或r2≥0. 985。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的MP DNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
a）若样品的C＜5.00E+002，则咽拭子样品的MP DNA总含量＜5.0×102基因拷贝，灌洗液标本的MP DNA含量为＜5.0×102基因拷贝/ml，痰液的MPDNA含量＜2.5×103基因拷贝／ml。
b）若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，则咽拭子样品的MP DNA总含量=C基因拷贝，灌洗液标本的MP DNA含量为=C基因拷贝／ml，痰液的MP DNA含量=5.0×C基因拷贝／ml。
c）若样品的C＞5. 00E+008，则咽拭子样品的MP DNA总含量为＞5.0×108基因拷贝，灌洗液标本的MP DNA含量为＞5.0×108基因拷贝／ml，痰液的MP DNA含量＞2.5×109基因拷贝／ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品的灵敏度为5.0×102基因拷贝／ml，线性范围为5.0×102 ～5.0×108基因拷贝／ml。
【临床意义】
结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。肺部感染由于感染菌的毒力、数量、机体的免疫状态不同，肺结核可有以下两类表现：
1.原发感染 多发生于儿童。初次感染的机体因缺乏特异性免疫，结核分枝杆菌常经淋巴管到达肺门淋巴结，引起肺门淋巴结肿大，称原发综合征。此时，可有少量结核分枝杆菌进入血液，向全身扩散，但不一定有明显症状（称隐性菌血症）；与此同时灶内巨噬细胞将特异性抗原递呈给周围淋巴细胞。感染3～6周，机体产生特异性细胞免疫，同时也出现超敏反应。病灶中结核分枝杆菌细胞壁磷脂，一方面刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞，后者相互融合或经核分裂形成多核巨细胞（即朗格汉斯巨细胞），另一方面抑制蛋白酶对组织的溶解，使病灶组织溶解不完全，产生干酪样坏死，周围包着上皮样细胞，外有淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，形成结核结节（即结核肉芽肿）是结核的典型病理特征。感染后约5%可发展为活动性肺结核，其中少数患者因免疫低下，可经血和淋巴系统，播散至骨、关节、肾、脑膜及其他部位引起相应的结核病。90%以上的原发感染形成纤维化或钙化，不治而愈，但病灶内常有一定量的结核分枝杆菌潜伏，不但能刺激机体产生免疫也可成为日后内源性感染的祸根。
2.继发感染 亦称复活感染，病灶亦以肺部为多见。病菌可以是外来的（外源性感染）或原来潜伏在病灶内（内源性感染）。由于机体已有特异性细胞免疫，因此继发感染的特点是病灶多局限，一般不累及邻近的淋巴结，被纤维素包围的干酪样坏死灶可钙化而痊愈。若干酪样结节破溃，排入邻近支气管，则可形成空洞并释放大量结核分枝杆菌至痰中。
【标本要求】
1.标本采集 以清晨第一口痰为宜。先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管中，密封，即可送检，合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样性质的痰液，痰量以3～5ml为宜。
2.样本预处理
（1）取痰液1.5ml，视痰标本性状加入1～2倍体积的4%NaOH于无菌样品管中，涡旋振荡1分钟，使痰液充分匀化，室温放置15～20分钟。
（2）样品处理管（1.5ml离心管，数量为：待测样本数+2），分别标记待处理样品编号及阳性、阴性对照。
（3）取液化好的痰液标本1ml于样品处理管中，13 000转／分钟离心5分钟，弃上清，该样本即为待测样本。
（4）加入1ml生理盐水重悬洗涤，13 000转／分钟离心5分钟，弃上清，加入50μl TB稀释液重悬。
3.保存 采集的样本在2～8℃保存不超过7天（建议不超过24小时）。待测样本（2.3中的沉淀物）在2～8℃保存不超过3天，-20℃或者-70℃冷冻保存3个月。
4.运输 密封冷藏（2～8℃）运输。
【方法与原理】
本试剂盒的结核分枝杆菌核酸检测分为核酸提取和恒温扩增检测。
在核酸提取过程中，细菌经超声破碎裂解释放出核酸RNA。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification andTesting，SAT）使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从双链DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照和阴性对照对检验结果进行判定。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）、超声波仪。
【试剂】
上海仁度生物科技有限公司结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
试剂组成：

组成成分
包装盖颜色
规格
TB稀释液
TB检测液
SAT酶液
TB反应液
TB阳性对照
TB阴性对照
白
棕
紫
黄
红
绿
2×1.0ml
1×40μl
1×200μl
1×600μl
1×50μl
1×50μl

（1） TB稀释液：含RNase抑制剂的溶液。
（2） TB检测液：含TB特异引物、特异荧光探针。
（3）SAT酶液：含反转录酶，T7聚合酶。
（4） TB反应液：含dNTPs、NTPs和扩增所需组分。
（5） TB阳性对照：含灭活的结核分枝杆菌菌液。
（6） TB阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。
【操作步骤】
1.试剂准备 按照每人份30μlTB反应液+2μl TB检测液配制扩增检测液，混匀离心备用。
2.核酸提取
（1）阳性对照：取2μl阳性对照加入198μl TB稀释液中，混匀备用。
（2）阴性对照：取2μl阴性对照加入198μl TB稀释液中，混匀备用。
（3）将50μl样本及50μl（1）中制备的阳性对照，50μl（2）中的阴性对照放入超声波清洗器中进行超声处理1 5分钟，超声功率为300W。
（4）超声结束后，取2μl处理物加入含30μl扩增检测液的洁净微量反应管中。
（5）60℃温浴10分钟，再42℃温浴5分钟，然后每孔加入42℃预热好的SAT酶10μl。
3.上机扩增 提前打开核酸扩增仪并设置扩增程序（42℃，40分钟，每分钟采一次荧光，选取FAM通道）。加好酶后要马上放入核酸扩增仪进行扩增。
4.质量控制
（1）应用临界弱阳性对照进行实验室质控：为了防止出现漏检（假阴性）的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
a）临界弱阳性对照的制备方法：将TB阳性对照用TB稀释液作10000倍稀释，即为临界弱阳性对照。
b）临界弱阳性对照的使用方法：取50μl临界弱阳性对照，放入超声波清洗器中进行超声处理15分钟，超声功率为300W，超声结束后，取2μl处理物加入含30μl扩增检测液的洁净微量反应管实验。
（2）质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的检测时间（detection time，dt）应满足以下条件：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40；否则，实验视为无效需重新进行。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的Ct值类似）。
5.结果判定
（1）阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
（2）结果判断
1） dt≤35的样本为阳性。
2）35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性。
3） dt无数值或为40的样本为阴性。
【参考范围】
通过对本试剂盒的最低检测下限浓度TB菌（1CFU/反应）进行大量实验统计分析，并结合正常人样本和临床阳性样本的检测数据，确定95%置信区间为：dt值≤35.99%置信区间的dt值范围为：dt＜40。
【临床意义】
沙眼衣原体（CT）所引起的生殖道感染已成为最常见的性传播疾病，且仍有上升趋势，常与淋病奈瑟菌混合感染。沙眼衣原体可导致尿道炎、附睾炎、Reiter综合征、子宫颈炎、盆腔炎、直肠炎、眼结膜炎。沙眼衣原体上行感染子宫内膜、输卵管，引起盆腔炎（PID）、不育及异位妊娠（也称宫外孕）等。其中，由母亲垂直传播给新生儿的感染率可达60%～70%。感染沙眼衣原体的妇女怀孕后在妊娠和分娩过程中发生流产、早产、胎膜早破、低体重儿等危险的几率会大大增加。
检测沙眼衣原体有助于对泌尿系统疾病和生殖系统疾病的诊断，及早诊治，及时治疗，控制传播。还可以对沙眼衣原体感染患者进行临床疗效评价。疗效评价通常在治疗7～10天，第一次评价后1～2周及完成治疗后4～6周进行。
【标本要求】
1.标本采集
（1）尿样标本：取清晨首次尿，或长时间（至少1小时）不排尿后的首段尿0. 5ml，与0.5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
（2）拭子标本：将医用棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口约1～2cm，旋转1周，停留10秒钟后取出，放入1ml生理盐水浸泡，然后贴管壁挤干，取0.5ml加入0. 5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
2.保存待测样本在2～8℃保存不应超过30天，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，应避免反复冻融。
3.运输 密封冷藏（2～8℃）运输。
【方法与原理】
本试剂盒的沙眼衣原体核酸检测分为核酸提取和恒温扩增检测。
在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸（RNA）。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Tes-tlng，SAT）使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从双链DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照和阴性对照对检验结果进行判定。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）、磁力架、电动吸引器。
【试剂】
上海仁度生物科技有限公司沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
试剂组成：

组成成分
包装盖颜色
规格
尿样保存液
核酸提取液
洗涤液
CT反应液
CT检测液
SAT酶液
CT阳性对照
CT阴性对照
白
白
白
黄
棕
紫
红
绿
1×10ml
2×1ml
1×40ml
1×800μl
1×50μl
1×200μl
1×50μl
ixsoui

（1）尿样保存液：含去垢剂，用于保存细菌RNA。
（2）核酸提取液：含捕获探针和磁性颗粒，用于结合病原体RNA。
（3）洗涤液：含SDS。
（4） CT反应液：含dNTPs、NTPs和扩增所需组分。
（5）CT检测液：含CT特异引物、特异荧光探针。
（6） SAT酶液：含逆转录酶，T7聚合酶。
（7）CT阳性对照：含CT RNA。
（8）CT阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。
【操作程序】
1.试剂准备 按照每人份40μl反应液+2. 5μl检测液配制扩增检测液，混匀备用。
2.核酸提取
（1）取400μl已加好尿样保存液的标本（阴阳对照的做法是200μl生理盐水+200μl尿样保存液+10μl对照），加入100μl核酸提取液。震荡，60℃温浴5分钟，再室温放置10分钟。
（2）将其放在磁力架上，吸附磁珠5分钟。待磁珠吸附到管壁一侧后，用真空泵吸走废液。然后加入1ml洗涤液，震荡混匀，继续吸附。吸附好后，再次吸走废液。再重复洗涤一次。
（3）最后一次要尽量吸干净废液，然后向其中加入步骤1中配好的扩增检测液40μl，震荡，让磁珠悬浮其中。然后转移30μl到微量反应管中。60℃温浴10分钟，然后再42℃温浴5分钟。然后每孔加入42℃预热好的SAT酶10μl。
3.上机扩增 提前打开核酸扩增仪并设置扩增程序（42℃，40分钟，每分钟采一次荧光，选取FAM通道）。加好酶后要马上放入核酸扩增仪进行扩增。
4.质量控制
（1）应用临界弱阳性对照进行实验室质控：为了防止出现漏检（假阴性）的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
a）临界弱阳对照的制备：取生理盐水和尿样保存液按照1:1混合作为稀释液，将试剂盒提供阳性对照品（105 copies/反应）稀释100倍即为临界弱阳性对照（103 copies/反应）。
b）临界弱阳性对照的使用方法：取0. 2ml生理盐水加入0.2ml尿样保存液中，混匀后加入10μl临界弱阳性对照，混匀备用；样本处理和检测过程同阳性对照和阴性对照。
（2）实验质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的检测时间（detection time，dt）值应满足以下条件：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40；否则，实验视为无效，需重新进行。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的Ct值类似）。
5.结果判定
（1）阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
（2）结果判断
1） dt≤35的样本为阳性。
2）35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性。
3）dt无数值或为40的样本为阴性。
【参考范围】
通过对检测下限浓度RNA大量实验统计分析，并结合体检者样品和阳性样品的实验数据，确定95%覆盖下dt≤35.99%覆盖下dt＜40。
【临床意义】
肠道病毒通用型（EV）感染可导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿等症状或并发症，严重者可导致死亡。采用实时荧光RT-PCR方法，对粪便、咽拭子、疱疹液样本中的EV核酸进行定性检测对EV感染的诊断有重要的参考价值。
【标本要求】
1.种类 粪便、咽拭子、疱疹液等。
2.标本取样量及保存方法 样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。
（1）粪便样本：采集患者发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量每份5～8g，采集后立即放入无菌采便管内。
（2）咽拭子样本：采集患者发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
（3）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份样本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
（4）标本保存和运送：样本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为4个月；长期保存，请置于-70℃；临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，样本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。
【方法与原理】
1.方法 荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，以EV基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增对EV RNA进行定性检测。临床样本使用商业化核酸提取试剂进行RNA提取后，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配制成PCR反应管。将核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（Ct值）实现对未知样本的定性检测。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司肠道病毒通用型（EV）核酸扩增荧光检测试剂盒
试剂盒组成（不可拆分）：

组分名称
规格
数量
EVRT-PCR反应液
逆转录酶系
Taq酶系
阴性质控品
EV强阳性质控品
360μl/管
50μl／管
75μl管
300μl／管
300μl／管
1
1
1
1
1

【操作程序】
1.RNA提取 建议取200μl液态样本进行核酸提取。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸柱提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的阴性、阳性质控品均参与提取，分别用于对环境监控和PCR检测试剂的质控。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（EV RT-PCR反应液15 μl／人份十逆转录酶系2μl／人份+Tag酶系3μl/人份）取相应量的RT-PCR反应液、逆转录酶系及Taq酶系，充分混匀后按20μl／管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、阳性质控品）上清液5μl，3000转／分钟离心30秒，放入仪器样品槽。（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择EV的程序，点击窗口右下角的 ，核对EV反应程序（40℃25分钟；94℃3分钟；93℃2分钟；93℃15秒→55℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名，点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“TemperatureTargets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Tem-plate”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择未知标本、阳性对照／阴性对照 。
 
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图；再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且阳性质控品Ct＜30。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果检测样本无典型S形扩增曲线或Ct值＞34.9，则判样本为EV阴性。
（2）如果检测样本呈典型S形扩增曲线且Ct值≤34.9，则判样本为EV阳性。
通过临床试验结果分析，利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的参考范围为Ct值等于35.1。试剂盒灵敏度：使用CCID50标定法为5.0×102 CCID50/0.1ml；使用空斑计数法为2.0×103 PFU/ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒（肠道病毒71型、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒等）无交叉反应。
【临床意义】
用于定性检测呼吸道样本中甲型H1N1流感病毒核酸，可用于该病毒感染的实验室诊断和监控。
【标本要求】
1.种类 咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道样本。
2.标本取样量及保存方法 请参照卫生部发布的《甲型H1N1流感监测方案（第一版）》及相应的附录3《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案（试行）》的要求。遵循目前的流感标本采集方案以及标准的流感标本储存、包装和运送标准和相应的国际航空运输协会的规定。
【方法与原理】
1.方法 实时荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，分别以甲型H1N1流感病毒HA和NA两个基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增甲型H1N1流感病毒基因组的RNA进行H1型和N1型的定性检测。另外，通过内标物质对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司甲型H1N1流感病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒
试剂盒组成（不可拆分）：

组分名称
规格
数量
核酸提取试剂
离心柱
24个／包
1
收集管
96个／包
1
病毒裂解液
5.5ml/瓶
1
抑制物去除液（浓缩液）
7.5ml／瓶
1
去离子液（浓缩液）
5.5ml／瓶
1
洗脱液
3ml／瓶
1
蛋白酶K（干粉）
—
1
CarrierRNA（干粉）
—
1
PCR检测试剂
IVAH1引物探针混合液
25μl／管
1
IVAN1引物探针混合液
25μl／管
1
一步法RT-PCR反应液
250μl/管
1
一步法RT-PCR反应酶系
150μl／管
1
DEPC H2O
2000μl／管
1
内标溶液
150μl／管
1
质控品
阴性质控品
200μl／管
2
IVAH1N1阳性质控品
200μl／管
2

【操作程序】
1.RNA提取使用商品化的试剂盒或按照以下步骤操作。标本（含阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）
（1）实验前准备
1）抑制物去除液（浓缩液）中加入5ml的无水乙醇，并在管盖上打钩。室温保存。
2）去离子液（浓缩液）中加入22ml的无水乙醇，并在管盖上打钩。室温保存。
3）蛋白酶K（干粉）中加入1. 375ml的洗脱液，充分混匀，溶解。- 20℃保存。
4）Carrier RNA（干粉）中加入110μl的内标溶液，充分混匀，溶解。- 20℃保存（Carrier RNA为白色或半透明物质，请仔细检查，确保其完全溶解）。
注：①如将病毒裂解液、抑制物去除液不恰当地放置在低温时，可能会出现结晶沉淀。37℃温育至其消失即可。
②使用前须将5ml裂解液与100μl Carrier RNA混合（25人份用量），颠倒10次，充分混匀（最好现配现用）。
（2）样本处理与RNA提取
1）液态标本处理（含阴性质控品、鼻咽分泌物、IVA H1N1阳性质控品）
a）在1. 5ml的无菌离心管内加入50μl的蛋白酶K。
b）取液态样本200μl加入离心管中（待测样本不足200μl时请补加适量生理盐水重悬）。
c）再加入200μl的病毒裂解液（已含Carrier RNA），盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混匀，高速离心10秒（防止温育时产生气泡），72℃10分钟。同时可将洗脱液置于72℃预热。
d）加入250μl无水乙醇，振荡15秒。
e）将混合液全部吸至离心柱，室温下12 000转／分钟离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。
f）将500μl的抑制物去除液加入离心柱，室温下12 000转／分钟离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。
g）将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12 000转／分钟离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。
h）再次将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12 000转／分钟离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。
i）将离心柱-收集管于室温下最大转速离心3分钟以除去残余的乙醇。
j）将离心柱取出，放置于新的1. 5ml离心管。打开离心柱盖子，72℃放置2分钟（使用于式恒温器，不能使用水浴锅）。
k）在离心柱的膜的正上方小心加入72℃预热的洗脱液50μl，盖紧离心柱管盖，室温静置1分钟后，最大转速离心1分钟。离心管内即为病毒核酸溶液，建议立即使用，如需保存，置于-20℃。
2）咽拭子等拭子类标本处理：咽拭子等标本须在运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上黏附的病毒及含有病毒的细胞等，后续处理同液态标本处理操作。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：分别配制甲型流感病毒（IVA） H1 RT-PCR反应体系和IVANl RT-PCR反应体系：取N个（N=阴性质控品+2×待测样本个数十阳性质控品）PCR反应管（按Hl和Nl两种反应体系计算）；每管分别加入一步法RT-PCR反应液5μl、一步法RT-PCR反应酶系3μl、IVA H1引物探针混合液1μl，加DEPC H2O补足至20μl（也可按照单个反应的用量，计算一步法RT-PCR反应液、一步法RT-PCR反应酶系、IVA H1或N1引物探针混合液、DEPC水各自所需总量，三者混匀后分装20μl于单个PCR反应管中）；IVA N1一步法RT-PCR反应体系配制时将上述步骤中的IVA Hl引物探针混合液改为IVAN1引物探针混合液，其他步骤相同。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）浊液5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择H1N1的程序，点击窗口右下角的 ，核对H1N1反应程序（50℃15分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；94℃15秒→58℃45秒（收集荧光），40个循环；探针模式为FAM和VIC双探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 立用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照
（5）实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Sub-set（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在NoiseBand中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。
 
3.质量控制
（1）阴性质控品：FAM检测通路荧光信号无增长，且无明显S形扩增曲线。
（2）强阳性质控品和临界阳性质控品：FAM荧光信号增幅明显，且扩增曲线呈典型S形扩增曲线。且强阳性质控品Ct值在9～12范围，临界阳性质控品Ct值在17～20范围。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果检测样品的H1及N1 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM检测通道无对数增长期或Ct值＞37，且在Vic检测通道有对数增长期，可判样品为甲型流感病毒H1N1阴性。
（2）如果检测样品的H1及N1 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM，Vic检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤35；或扩增曲线在FAM检测通道有对数增长期且Ct值≤35，在Vic检测通道无对数增长期，可判样品为甲型流感病毒H1N1阳性。
（3）如果检测样品H1及N1 RT-PCR反应体系的扩增曲线在Vic检测通道有对数增长期，且在FAM检测通道35＜Ct值≤37，需要对样品重新进行核酸提取和检测操作，若再次实验结果FAM检测通道Ct值≤35，且曲线有明显对数增长期，判样品为甲型流感病毒H1N1阳性；若FAM检测通道Ct值＞35，可判样品为甲型流感病毒H1N1阴性。
（4）如果检测样品的H1或N1 RT-PCR反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求，则需重复检测；若重复检测结果仍为H1（或N1）阳性，则只可判为甲型流感病毒H1（或N1）型阳性。
【参考范围】
确定本试剂盒的阳性样本参考范围为FAM检测通道Ct值≤35，阴性样本参考范围为FAM检测通道Ct值＞37，FAM检测通道35＜Ct值≤37为灰度区。根据产品分析性能评估结果，本试剂盒的灵敏度为1.0×103 PFU/ml。
【临床意义】
人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染不仅引起肉眼所见的尖锐湿疣，而且与宫颈上皮内瘤变（CIN）、宫颈癌发生、发展密切相关，久治不愈。到目前为止，已发现和鉴定出超过100种不同类型的HPV，有54种可以感染生殖道黏膜。依据HPV与癌瘤的关系，感染肛门生殖器的HPV可归类为低度危险、中度危险和高度危险型。低危型HPV常常在良性或轻度不典型增生病灶中检测到，而很少存在于癌灶中，如HPV6、11型与外生殖器和肛周区域的外生型湿疣关系密切。中危型HPV存在于中重度不典型增生病灶中，很少存在于癌灶中。高危型HPV则通常在重度不典型增生和癌灶中，如HPV16、18型可在大多数宫颈癌、一些肛管癌、阴茎癌和阴道癌中检测到。通过对HPV的检测，可反映病毒复制情况和水平，主要用于宫颈癌前的筛查，判断预后。并可监测病毒的疗效。
【标本要求】
1.种类 宫颈分泌物。
2.取量 分泌物拭子管（加0. 4ml的生理盐水）。
3.保存 分泌物拭子可2～8℃保存24小时，-20℃保存12个月对结果无影响。
【方法与原理】
1.方法 双色荧光聚合酶链式反应：简称PCR（Polymerase Chain Reaction）
2.原理 试剂采用了双色荧光探针，对体外特异性靶基因扩增后，可实时分型定量。此试剂是国际首个HPV病毒同时分型和定量的检测试剂盒。它可以进行高效率的单管多型别双检，同时检测多种型别。该试剂也是目前唯一采用世界卫生组织确认的β-球蛋白基因（β-globin gene）作为宫颈上皮细胞的国际标准内标。β-球蛋白基因是一种存在于上皮细胞中的管家基因，可作为宫颈、尿道上皮细胞的身份证，它能有效地避免因临床取样未获得足够的宫颈上皮细胞而导致的实验结果假阴性问题。引入内标，可以比较不同标本或同一标本不同时间的病毒载量，是真实定量。通过采用国际内标和双探针技术，该试剂最后可实现同时对人体分泌物样品进行病毒载量的绝对定量和病毒的多型别检测。
3.分析范围 100～108 copies/μl。
4.干扰因素标本的溶血。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
意大利AB公司配套试剂
1.试剂包组成（不可拆分）实时混合液；引物混合反应液1，2，3；探针混合反应液1；HPV16和HPV18的DNA质粒；HPV31和HPV58的DNA质粒；β-球蛋白的DNA质粒。
2.其他试剂及耗材 反应管、吸头。
3.质控品。
4.校准品。
【操作程序】
1.DNA提取（生殖泌尿道分泌物棉拭子标本为例）
（1）向采集管中加入1.5ml灭菌生理盐水，充分震荡混匀，挤干棉拭子。
（2）吸取全部液体转移至1.5ml离心管中，13000转／分钟离心10分钟。
（3）去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液（DNA提取液使用品牌，请咨询深圳创强医疗器械有限公司），充分混匀。
（4）100℃水浴10分钟，13000转／分钟离心10分钟。
（5）取上清备用。
2.试剂配制 按如下表准备PCR反应液：

反应1
反应2
反应3
AB Real Time Mix 2X
Primer Mix 1
Probe Mix 1
Primer Mix 2
Probe Mix 2
10μl
0.4μl
0.8μl
 
10μl
 
 
0.4μl
0.8μl
10μl
 
 
 

续表

反应1
反应2
反应3
Primer Mix3
Probe Mix3
H2O
Volume finale
 
 
6.8μl
18μl
 
 
6.8μl
18μl
0.4μl
 
 

每个反应加2μl提取的样本DNA或阳性对照DNA。
3.PCR扩增加入模板后，用防光盖密封并压紧反应管，确保每一管底部不存在气泡，以4000转／分钟，离心至少2分钟。如果不能离心，确保移液管将所有的悬浮液转移到反应管底部。
反应温度参数：检测HPV DNA的PCR步骤分三步：

参数
数值
数值
数值
循环数
1
1
40
段
1
2
温度
50℃
95℃
94℃
57℃
孵育时间
2min
3min
15s
40s

基线调整取5～15个循环的荧光信号，阈值设置刚好超过阴性对照品最高点。
4.结果判定 扩增完待检样本检测Ct值＜38，且扩增曲线呈典型的S形，报告为阳性定量值；待检样本Ct值显示在38～40，建议重复测定。
当HPV定量值≥1E+2基因拷贝时，则判定该定量值（基因拷贝数）为此待测样本的定量值（基因拷贝数）。
当HPV定量值＜1E+2基因拷贝时，则判定此待测样本为阴性。
【参考范围】
≤100copies/μl。
【临床意义】
呼吸道合胞病毒感染症状主要包括咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉不适等呼吸道局部症状和发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等全身症状，婴幼儿常伴发热、气急，X线胸片常显示明显的支气管肺炎和（或）毛细支气管炎表现。在成人和年长儿，感染可能症状不明显或仅表现为无热性上呼吸道感染（普通感冒）。呼吸道合胞病毒核酸检测是RSV感染的辅助诊断。
【标本要求】
1.种类 鼻咽分泌物。
2.标本取样量及保存方法 吸取鼻咽分泌物，密封送检，标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为12个月，标本运送采用0℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法 实时荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，以呼吸道合胞病毒基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过进行一步法RT-PCR扩增对呼吸道合胞病毒RNA进行检测。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
1.中山大学达安基因股份有限公司呼吸道合胞病毒（RSV）核酸扩增荧光定量检测试剂盒
试剂盒组成（不可拆分）：

组分名称
规格
数量
RNA提取液A
RNA提取液B
DEPC H2O
RT-PCR反应管
RSV强阳性质控品
RSV临界阳性质控品
阴性质控品
100μl/管
4ml／瓶
1.5ml／管
单管单人份
100μl/管
100μl/管
200μl/管
1管
1瓶
2管
10管
1管
1管
1管

不同批号试剂盒以上成分不可以互换使用。
2.自备试剂 75%乙醇：按无水乙醇：DEPC水=3：1（体积比）配制。
【操作程序】
1.RNA提取：标本（含阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）
（1）充分混匀RNA提取液A，吸取10μl/人份RNA提取液A加至1.5ml离心管中，然后再加入200μl RNA提取液B。
（2）取100μl待检样本或阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品至离心管中。
（3）充分振荡混匀，室温放置5分钟，8000转／分钟离心2分钟，弃上清。
（4）加入200μl RNA提取液B，吹打混匀，8000转／分钟离心2分钟，弃上清。
（5）加入4℃预冷的DEPC H2O配制的75%乙醇400μi，吹打混匀，8000转／分钟离心2分钟，弃上清。
（6）再加入4℃预冷的DEPC H2O配制的75%乙醇400μl，吹打混匀，8000转／分钟离心2分钟，弃上清，尽量吸去所有液体。
（7）打开管盖，65℃加热5分钟，使液体挥发完全。
（8）加入25μl DEPC H2O，吹打混匀管中沉淀，得到包含白色颗粒物的悬浊液，盖上管盖，冰上放置，用于RT-PCR检测。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：取相应量的PCR管转移至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）浊液10μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择RSV的程序，点击窗口右下角的 ，核对RSV反应程序（40℃30分钟；94℃3分钟；93℃15秒→55℃45秒10个循环；93℃15秒→55℃45秒（收集荧光）30个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图；再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。
 
3.质量控制
（1）阴性质控品：FAM检测通路荧光信号无增长，且无明显S形扩增曲线。 （2）强阳性质控品和临界阳性质控品：FAM荧光信号增幅明显，且扩增曲线呈典型S形扩增曲线。且强阳性质控品Ct值在9～12范围，临界阳性质控品Ct值在17～20范围。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果FAM检测通路荧光信号无增长，且无典型S形扩增曲线，则判定RSV RNA浓度低于灵敏度。
（2）如果FAM荧光信号增幅明显，扩增曲线呈典型S形扩增曲线，且Ct值小于等于25. 97，则判定RSV RNA阳性。
（3）如果FAM荧光信号增幅明显，且扩增曲线呈典型S形扩增曲线，但Ct值大于25. 97，则认为该样品处于灰度区，需复检进行确定。
复检结果符合阳性判断结果或仍处于灰区的判为阳性。符合阴性判为阴性。
 
图2-5过氧化物酶通道
 
图2-6 嗜碱性粒细胞通道
 
图2-7 网织红细胞通道
 
图2-8 流式细胞术检测原理
 
图2-9 流式细胞术检测光学原理
 
图2-10 白细胞／嗜碱性粒细胞散点图
 
图2-11 白细胞分类散点图
 
图2-12 白细胞分类散点图
 
图2-13 有核红细胞散点图
 
图2-14 网织红细胞散点图
 
图2-15 血小板散点图（光学法）
 
图2-16 幼稚细胞散点图
 
图2-21 白细胞分类散点图
 
图2-22 尿液有形成分分布散点图
 
图2-23 血清IgG型抗A/B抗体效价检测（微柱法）
 
图2-24 间接抗人球蛋白试验（微柱法）
 
图2-25 直接抗人球蛋白试验（微柱法）
 
图2-26 游离抗体试验和释放抗体试验（微柱法）
 
图2-27 T淋巴细胞亚群（CD3／CD4/CD8）检测
 
图2-28 B淋巴细胞检测
 
图2-29 NK淋巴细胞检测

 

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【医论】新英格兰医学杂志病例讨论 - 第十一次

作者:王泓  日期:2014-06-19

新英格兰医学杂志病例讨论 - 第十一次
 
在ICU中有尊严的死亡
 
2014年06月19日 

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病历摘要

一名77岁男性患者，既往史包括高血压和高脂血症（均控制良好），严重酗酒及轻度认知障碍。患者因乙状结肠穿孔导致粪性腹膜炎，并发感染性休克在ICU接受治疗15天。手术后，患者接受机械通气。在ICU住院期间，患者的并发症包括轻度DIC，对乙酰氨基酚引起的急性肝坏死。转入外科病房后，患者发生坠床，头颅CT提示急性硬膜下血肿伴出血导致挫裂伤，中线结构移位5 mm。（在前一次有关颅脑创伤治疗措施的投票中，共有2898人参加。超过2/3的人[67%]主张进行急性硬膜下血肿清除，放置脑室外引流管，并收入ICU积极控制颅内高压。另有26%的人建议进行急性硬膜下血肿清除，收入ICU，但不监测颅内压，还有6%的人选择保守治疗，理由是患者功能恢复的可能性很小。）

患者在手术室接受了开颅手术，清除了硬膜下血肿。手术后没有应用镇静药物，术后12天患者仍处于昏迷状态，最好的运动反应为左侧肢体异常的屈曲动作。患者仍然接受机械通气。主治医生一致认为患者功能恢复的可能性很小。

问题

有关患者的后续治疗，应当如何做出决定？请参与投票，如果你愿意，可以发表评论以支持你的观点。编辑的意见及相关总数将于6月26日发表。

相关选项

  • 约见患者家属，告知患者恢复无望，因此将停止机械通气
  • 约见患者家属，目的在于了解患者自身有关继续积极治疗的意愿，以及积极治疗后最可能出现的结果（最好的情况是住在安养院且需要照顾）是否符合患者意愿
  • 约见家属，询问是否愿意接受气管切开手术
  • 约见家属，告知你决定进行气管切开手术

 

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【医论】新英格兰医学杂志病例讨论 - 第十次投票结果

作者:王泓  日期:2014-06-19

新英格兰医学杂志病例讨论 - 第十次投票结果
CSCCM
2014年05月29日 

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病历摘要

一名77岁男性患者，既往史包括高血压和高脂血症（均控制良好），严重酗酒及轻度认知障碍。患者因乙状结肠穿孔导致粪性腹膜炎，接受了Hartmann手术（直乙状结肠切除，远端直肠关闭，近端结肠造瘘）后从手术室收入ICU。手术后，患者接受机械通气，针对ARDS使用小潮气量及呼气末正压(PEEP)，且接受了感染性休克的治疗。在ICU住院期间，患者的并发症包括轻度DIC，对乙酰氨基酚引起的急性肝坏死。尽管积极进行活动，但仍发生了ICU获得性肌无力。（在前一次有关肌无力治疗的投票中，共有1937人参加。绝大多数人[94%]主张即使在接受机械通气时，也应当尽可能减少镇静，加强早期主动和被动活动。另有4%的人建议在ICU住院期间维持血糖水平80 - 110 mg/dl [4.4 - 6.1 mmol/L]，还有1%的人主张使用生长激素改善患者氮平衡，加强肌肉力量）。

住ICU后15天，患者脱离机械通气，转入外科病房。从ICU转出后的第3天早上，人们发现患者躺在房间的地板上，显然是从床上坠落造成的。体格检查发现患者可自行睁眼但无法清楚地说话。右侧肢体活动减少。双侧瞳孔中等大小，对光反射存在。头颅CT检查发现左侧急性硬膜下血肿伴出血导致挫裂伤，中线结构移位5 mm。

 

问题

由对于患者颅脑创伤，应采取何种治疗措施？投票与评论目前已经结束。编辑的推荐意见如下。

答案

截至2014年5月28日，共有2898人参加了投票TBI

 

在ICU接受15天治疗后，我们的患者很可能罹患重要的后遗症，包括肌肉力量减弱和活动功能障碍。跌倒是住院患者重要的医疗安全问题，一项研究显示1，估计发病率为2.1 - 8.4次/1000个住院日，每200次跌倒中就有1次可以对患者造成严重的伤害。

我们的患者跌倒后发生了急性颅脑创伤。最初对患者进行检查发现，其Glasgow昏迷评分为9分。患者具有定位体征，提示左侧大脑半球发生急性卒中或创伤性脑出血。CT扫描确诊为急性创伤性硬膜下血肿。颅脑创伤患者的年龄呈双相分布，青年人和老人的发病率最高；对于老年人而言，跌倒是最常见的原因。高龄是颅脑创伤患者预后不良的独立危险因素，但经过持续高强度的医疗和康复治疗后，患者仍可能有相当程度的恢复。

如果患者没有预嘱表示放弃积极治疗，此时合理的治疗措施应当包括清除急性硬膜下血肿，并留置颅内压监测管。尽管监测颅内压并不能改善临床预后2，国际指南仍建议进行颅内压监测，并根据监测结果指导所有重度颅脑创伤且有可能恢复的患者的治疗3。

颅内压升高的治疗策略通常采取逐步加强治疗强度的做法，首先通过机械通气保证PaCO2正常，镇静并引流脑脊液（对留置脑室引流的患者而言）。二线治疗措施包括渗透性利尿，诱导性过度通气，低体温及代谢抑制（巴比妥昏迷），而对于既往健康的顽固性颅内高压的年轻患者，考虑进行开颅减压。由于我们的患者高龄且预后不明确，因此合理的措施为镇静和机械通气，留置引流清除脑脊液，48 - 72小时进行评估判断有无病情恢复的表现。如果没有病情恢复的迹象或出现顽固性颅内高压，则应将治疗重点转向和缓治疗。

相关文章

如欲了解更多内容，请参见新英格兰医学杂志2014年5月29日发表的危重病医学系列文章之十，由N. Stocchetti和A.I.R. Maas撰写的Traumatic Intracranial Hypertension。本例后续情况请关注6月11日网站内容。

REFERENCES

1. Healey F, Scobie S, Oliver D, Pryce A, Thomson R, Glampson B. Falls in English and Welsh hospitals: a national observational study based on retrospective analysis of 12 months of patient safety incident reports. Qual Saf Health Care 2008;17:424-30.
2. Chesnut RM, Temkin N, Carney N, et al. A trial of intracranial-pressure monitoring in traumatic brain injury. N Engl J Med 2012;367:2471-81.
3. Brain Trauma Foundation. Guidelines for the management of severe traumatic brain injury. J Neurotrauma 2007;24:Suppl 1:S1-106.

 

 

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【医论】新英格兰医学杂志病例讨论 - 第十次

作者:王泓  日期:2014-06-19

新英格兰医学杂志病例讨论 - 第十次
 
创伤性颅高压
 
CSCCM
2014年05月19日
 

critcare10_lg

病历摘要

一名77岁男性患者，既往史包括高血压和高脂血症，严重酗酒及轻度认知障碍。患者因乙状结肠穿孔导致粪性腹膜炎，接受了Hartmann手术（直乙状结肠切除，远端直肠关闭，近端结肠造瘘）后从手术室收入ICU。手术后，患者因ARDS接受小潮气量通气及呼气末正压(PEEP)。同时患者接受针对感染性休克的治疗。在ICU住院期间的并发症包括轻度DIC，以及对乙酰氨基酚治疗导致的急性肝坏死。尽管进行了积极的活动，但患者仍出现了一定程度的ICU获得性肌无力。（在前一次病例投票中, 共有1937人针对如何治疗肌无力进行了投票。大多数人[94%]主张尽可能减轻镇静，即使在接受机械通气过程中也应尽早开始早期主动及被动活动。另有4%的调查者认为在ICU住院期间应当控制血糖水平80 - 110 mg/dL [4.4 - 6.1 mmol/L]，还有1%的人选择使用人生长激素改善患者氮平衡并促进肌力恢复）。

住ICU第15天时患者脱离呼吸机并转入普通病房。从ICU转出后的第3天早上，人们发现患者躺在房间的地板上，显然是从床上坠落造成的。体格检查发现患者可自行睁眼但无法清楚地说话。右侧肢体活动减少。双侧瞳孔中等大小，对光反射存在。头颅CT检查发现左侧急性硬膜下血肿伴出血导致挫裂伤，中线结构移位5 mm。

问题

 对于患者颅脑创伤，应采取何种治疗措施？请参与投票，如果你愿意，可以发表评论以支持你的观点。编辑的意见及相关综述将于4月24日发表。

请参与投票，如果你愿意，可以发表评论以支持你的观点。编辑的意见及相关综述将于5月29日发表。

相关选项

  • 因神经系统功能无法恢复，采取保守治疗
  • 清除急性硬膜下血肿，植入脑室外引流，并收入ICU积极控制颅内压
  • 清除急性硬膜下血肿，收入ICU，治疗但不监测颅内压

 

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