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【医技】检验科医疗诊疗规——第三篇 临床微生物检验111-121

作者:王泓 日期:2014-06-19

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【临床意义】
柯萨奇病毒A16型（CA16）感染可导致手足口病，为手足口病的主要病原体。也可引起疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿等症状或并发症，严重者可导致死亡。人是肠道病毒唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源。肠道病毒主要经粪-口和（或）呼吸道飞沫传播，亦可经接触患者皮肤、黏膜泡疹液而感染。采用实时荧光RT-PCR方法，对粪便、咽拭子、疱疹液样本中的CA16核酸进行定性检测可对CA16感染的诊断有重要的参考价值。有助于临床有针对性地采取治疗措施，使患者的病情尽快好转。柯萨奇病毒核酸测定，也可对其感染患者进行药物治疗的疗效监控。及早治疗，预防传播。
方法1：达安基因柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸扩增荧光检测试剂盒
【标本要求】
1.种类粪便、咽拭子、疱疹液等。
2.标本取样量及保存方法样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。
（1）粪便样本：采集患者发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量每份5～8g，采集后立即放入无菌采便管内。
（2）咽拭子样本：采集患者发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
（3）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份样本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
（4）标本保存和运送：样本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为4个月；长期保存，请置于-70℃；临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，样本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。
【方法与原理】
1.方法 荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，以CA16基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增对CA16 RNA进行定性检测。临床样本使用商业化核酸提取试剂进行RNA提取后，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配制成PCR反应管。将核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（CT值）实现对未知样本的定性检测。 【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸扩增荧光检测试剂盒

组分名称
规格
数量
CA16RT-PCR反应液
逆转录酶系
Taq酶系
阴性质控品
CA16强阳性质控品
360μl／管
50μl／管
75μl/管
300μl管
300μl/管
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.RNA提取 建议取200μl液态样本进行核酸提取。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸柱提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的阴性、阳性质控品均参与提取，分别用于对环境监控和PCR检测试剂的质控。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（CA16 RT-PCR反应液15μl／人份十逆转录酶系2μl／人份+Taq酶系3μl／人份）取相应量的RT-PCR反应液、逆转录酶系及Taq酶系，充分混匀后按20μl／管分装至LightCycler4 80Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、阳性质控品）上清液5μl，3000转／分钟离心30秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择CA16的程序，点击窗口右下角的 ，核对CA16反应程序（400C 25分钟；94℃3分钟；93℃2分钟；93℃15秒→55℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Tem-plate”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择未知标本、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图；再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
 
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且阳性质控品Ct＜30。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果检测样本无典型S形扩增曲线或Ct值＞34.8，则判样本为CA16阴性。
（2）如果检测样本呈典型S形扩增曲线且Ct值≤34.8，则判样本为CA16阳性。
【参考范围】
通过临床试验结果分析，利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的参考范围为Ct值等于35.1。试剂盒灵敏度：使用CCID50标定法为1.0×10z CCID50/0.1ml；使用空斑计数法为1.0×103 PFU／ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒（肠道病毒71型、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒等）无交叉反应。
方法2：上海之江CA16配套试剂
【标本要求】
1.种类咽拭子、粪便、疱疹液、血清和血浆（枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.标本取样量及保存方法样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。
（1）粪便样本：采集患者发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量每份5～8g，采集后立即放入无菌采便管内。
（2）咽拭子样本：采集患者发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
（3）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份样本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
（4）静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.标本保存和运送样本可立即用于测试，含生理盐水的拭子可2～8℃保存24小时，也可保存于-20℃待测，保存期为4个月。长期保存，请置于-70℃。临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，样本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。
【方法与原理】
1.方法 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）
2.原理 用特异性RNA核酸片段进行体外逆转录和扩增的荧光PCR检测过程。
（1）分析范围：1000～108 copies／ml。
（2）干扰因素：标本的溶血，留取时污染。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
上海之江公司CA16配套试剂。
1.试剂包组成：
（1） CA16荧光PCR检测混合液。
（2）RT-PCR酶。
（3） DEPC-H2O。
（4）阳性对照品。
2.其他试剂及耗材
（1） Trizol。
（2）氯仿。
（3）异丙醇。
（4）75%乙醇。
3.质控品 H2O检测显示UNDET（ABI荧光定量PCR仪）。
4.校准品。
【操作步骤】
1.标本和内部对照品的核酸裂解处理用Trizol法提取，取100μl样本置于1. 5ml离心管中，加300μl裂解液（Trizol），再加100μl氯仿，振荡器上震荡混匀5秒，13 000转／分钟离心15分钟，取上层液体加等体积的异丙醇，颠倒混匀室温静置10分钟，13 000转／分钟离心10分钟，轻轻倒去上清，加700μl的75%乙醇，颠倒洗涤，13 000转／分钟离心5分钟，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上。弃尽液体后，加20μl DEPC-H2O溶解RNA。
2.试剂配制 取N×19μl CA16荧光PCR检测混合液与N×1μl RT-PCR酶（N为反应管数），震荡混匀数秒，3000转／分钟离心数秒。
3.加样 取上述混合液20μl置薄壁PCR管或PCR反应板中，然后将标本、阴性对照品、内部阳性对照品的处理上清各5μl加入薄壁PCR管或PCR反应板中，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，立即进行PCR扩增反应。
4.PCR扩增 反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数设置：45℃×10分钟；95℃×5分钟；循环一次，95℃×15秒→60℃×60秒，循环40次。余同达安PCR扩增。
5.基线和阈值设定 基线调整取5～15个循环的荧光信号，阈值设置刚好超过阴性对照品的最高点。
【参考范围】
阴性。
【临床意义】
EB病毒（EBV）感染呈全球性，我国80%～90%成人感染过EBV。儿童原发性感染几乎没有症状，但大多数青壮年感染呈传染性单核细胞增多症（infec-tious mononucleosis，IM）表现。其主要症状为发热、咽喉痛、淋巴结肿大和血清转氨酶升高。但在对于使用免疫抑制患者可能是致死性的原因之一。EBV与一些肿瘤有密切的病因学关系，如非洲儿童恶性淋巴瘤（Burkitt淋巴瘤）及鼻咽癌以及霍奇金淋巴瘤、免疫缺陷患者B细胞淋巴瘤、艾滋病中枢神经系统淋巴瘤及接受同种异体移植者的鼻咽部T细胞淋巴瘤等。
唾液传播是主要方式，也可通过空气和血液传播。EBV的检测临床意义越来越大。血清学的检测受个体差异影响较大。EBV核酸检测由于敏感性高，在EBV感染及其相关疾病的诊断中发挥重要的作用，也是对其他检测系统的补充，可以做到早期辅助诊断，最大限度地避免漏检。有助于临床有针对性地采取治疗措施，使患者的病情尽快好转。及早治疗，预防传播。EBV核酸检测也可对其感染患者进行药物治疗的疗效监控。
【方法与原理】
1.方法实时荧光定量PCR检测法。
2.原理用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒（EBV） DNA。
【标本要求】
1.种类全血（淋巴细胞）。
2.标本取样量及保存方法全血（淋巴细胞）用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含乙二胺四乙酸二钠（EDTA）或枸橼酸钠抗凝剂的采血管，立即轻轻颠倒采血管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测（全血除外），保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司：EB病毒核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒

组分名称
规格
数量
DNA提取液
EBPCR反应液
Taq酶
阴性质控品
EB弱阳性质控品
500μl／管
400μl／管
60μl/管
150μl／管
200μl/管
2
2
1
1
1

续表

组分名称
规格
数量
EB强阳性质控品
EB阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝／ml）红色
EB阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝／ml）黄色
EB阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝／ml）蓝色
EB阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝／ml）绿色
200μl／管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性质控品处理：取出阴性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（2）标本处理
1）取全血1ml至干燥无菌试管中，加入生理盐水1ml轻摇混匀。
2）取干燥无菌试管加入500～700μl淋巴细胞分离液。
3）将稀释好的全血用加样器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿着管壁，速度要慢），1500转／分钟，离心20分钟（建议用水平离心机）。
4）吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1. 5ml离心管，12 000转／分钟离心5分钟。
5）去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
6）12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（3） EB弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（4） EB强阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（5）EB阳性定量参考品处理震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（EB PCR反应液40μI／人份+Taq酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42.5μl／管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2. 5μl，直接加入阳性定量参考品2. 5μl 8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：EB反应程序（93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针。
（4）结果分析：选择Abs Quant/Fit point分析模式，在窗口中的Subset（第二行）选择本次实验的子集。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在6. 310×106～1. 000×108基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在6. 310×103～1. 000×105基因拷贝／ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的EB DNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
1）若样品的C＜5. 00E+003，全血样品EB DNA总含量＜5.0×103基因拷贝／ml；
2）若样品的5.00E+003≤C≤5.00E+007，全血样品EB DNA=C基因拷贝/ml；
3）若样品的C＞5.00E+007，全血EB DNA总含量＞5.0×107基因拷贝/ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品的灵敏度为5.0×103基因拷贝／ml，线性范围为5.0×103～5.0×107基因拷贝／ml。
【临床意义】
EV71感染与Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。人是肠道病毒唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源。肠道病毒主要经粪一口和（或）呼吸道飞沫传播，亦可经接触患者皮肤、黏膜泡疹液而感染。目前已知EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎，甚至致死性肺水肿。可伴有严重的CNS并发症，无菌性脑膜炎等多种与神经系统相关的疾病。严重者可导致死亡。采用实时荧光RT-PCR方法，对粪便、咽拭子、疱疹液、血液样本中的EV71核酸进行定性检测，可对EV71感染提供病原学诊断依据，并对此病毒感染治疗进行疗效监测。
检验方法1：上海之江EV71配套试剂
【标本要求】
1.种类咽拭子、粪便、疱疹液、血清（枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
2.标本取样量及保存方法样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。
（1）粪便样本：采集患者发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量每份5～8g，采集后立即放入无菌采便管内。
（2）咽拭子样本：采集患者发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
（3）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份样本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
（4）静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
3.标本保存和运送样本可立即用于测试，含生理盐水的拭子可2～8℃保存24小时，也可保存于- 20℃待测，保存期为4个月。长期保存，请置于-70℃。临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，样本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。
【方法与原理】
1.方法 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）。
2.原理用特异性RNA核酸片段进行体外逆转录和扩增的荧光PCR检测过程。
（1）分析范围：1000～108 copies／ml。
（2）干扰因素：标本的溶血。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
上海之江公司EV71配套试剂。
1.试剂包组成（不可拆分） EV71荧光PCR检测混合液；RT-PCR酶；DEPC-H2O；阳性对照品。
2.其他试剂及耗材 ①Trizol；②氯仿；③异丙醇；④75%乙醇。
3.质控品 H2O检测显示UNDET（ABI荧光定量PCR仪）。
4.校准品。
【操作步骤】
1.标本和内部对照品的核酸裂解处理用Trizol法提取：取100μl样本置于1. 5ml离心管中，加300μl裂解液（Trizol），再加100μl氯仿，振荡器上震荡混匀5秒，13 000转／分钟离心15分钟，取上层液体加等体积的异丙醇，颠倒混匀室温静置10分钟，13 000转／分钟离心10分钟，轻轻倒去上清，加700μl的75%乙醇，颠倒洗涤，13 000转／分钟离心5分钟，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上。弃尽液体后，加20μl DEPC-H2O溶解RNA。
2.试剂配制 取N×19μl EV71荧光PCR检测混合液与N×1μl RT-PCR酶（N为反应管数），震荡混匀数秒，3000转／分钟离心数秒。
3.加样 取上述混合液20μl置薄壁PCR管或PCR反应板中，然后将标本，阴性对照品，内部阳性对照品的处理上清各5μl加入薄壁PCR管或PCR反应板中，盖好薄壁PCR反应管盖或PCR反应板膜，立即进行PCR扩增反应。
4.PCR扩增反应管置于定量荧光PCR仪上，循环参数设置：45℃×10分钟；95℃×5分钟；循环一次，95℃×15秒→60℃×60秒，循环40次。
5.基线和阈值设定基线调整取5～15个循环的荧光信号，阈值设置刚好超过阴性对照品的最高点。Ct值在35附近为弱阳性结果。Ct值大于38建议重复检测一次。
检验方法2：达安基因肠道病毒71型（EV71）核酸扩增荧光检测试剂盒
【标本要求】
同上海之江公司试剂盒，但不适用于血清标本。
【方法与原理】
1.方法 荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，以EV71基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增对EV71 RNA进行定性检测。临床样本使用商业化核酸提取试剂进行RNA提取后，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配制成PCR反应管。将核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（Ct值）实现对未知样本的定性检测。
【仪器】
高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司肠道病毒71型（EV71）核酸扩增荧光检测试剂盒
试剂盒组成（不可拆分）：

组分名称
规格
数量
EV71RT-PCR反应液
逆转录酶系
Taq酶系
阴性质控品
EV71强阳性质控品
360μl/管
50μl/管
75μl／管
300μl／管
300μl/管
1
1
1
1
1

【操作程序】
1.RNA提取 建议取200μl液态样本进行核酸提取。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸柱提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的阴性、阳性质控品均参与提取，分别用于对环境监控和PCR检测试剂的质控。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（EV71 RT-PCR反应液15μl/人份十逆转录酶系2μl／人份+Tag酶系3μl/人份）取相应量的RT-PCR反应液、逆转录酶系及Taq酶系，充分混匀后按20μI/管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、阳性质控品）上清液5μl，3000转／分钟离心30秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择EV71的程序，点击窗口右下角的 ，核对EV71反应程序（40℃25分钟；94℃3分钟；93℃2分钟；93℃15秒→55℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Tar-gets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Pro-grams”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择未知标本、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs QuantlFit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图；再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Effi-ciency:1. 8～2.1为有效。
 
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且阳性质控品Ct＜30。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果检测样本无典型S形扩增曲线或Ct值＞35.1，则判样本为EV71阴性。
（2）如果检测样本呈典型S形扩增曲线且Ct值≤35.1，则判样本为EV71阳性。
通过临床试验结果分析，利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的参考范围为Ct值等于35.1。试剂盒灵敏度：使用CCID50标定法为1.0×102 CCID50/0.1ml；使用空斑计数法为1.0×103 PFU／ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒（柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒等）无交叉反应。
【参考范围】
阴性。
【临床意义】
检测漱口水、胃液或胃黏膜组织等样本中幽门螺旋杆菌（Hp） DNA，可用于胃及十二指肠溃疡或炎症、胃癌的病原学鉴别诊断，药物治疗效果的评估。
【标本要求】
1.种类漱口水、胃液、胃黏膜组织等。
2.标本取样量及保存方法
（1）漱口水、胃液：取漱口水或胃液1～5ml于无菌的干燥玻璃管中，密封送检。
（2）胃黏膜组织：取胃窦部黏膜组织适量，置无菌玻璃管，密闭送检。
（3）标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法实时荧光定量PCR检测法。
2.原理用一对幽门螺旋杆菌（Hp）特异性引物和一条幽门螺旋杆菌（Hp）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测幽门螺旋杆菌（Hp） DNA。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司幽门螺旋杆菌（Hp）核酸扩增荧光定量检测试剂盒

组分名称
规格
数量
DNA提取液
HpPCR反应液
Taq酶
500μl／管
400μl／管
60μl／管
2
2
1

续表

组分名称
规格
数量
阴性质控品
Hp弱阳性质控品
Hp强阳性质控品
Hp阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）红色
Hp阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/ml）黄色
Hp阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝／ml）蓝色
Hp阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）绿色
150μl／管
200μl／管
200μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
1
1
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性、阳性质控品处理：取出阴性、阳性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（2）标本处理
漱口水（漱口水和胃液标本处理相同）
①摇匀漱口水，取1～1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
②去上清，沉淀（沉淀如不明显，可重复前两步骤一遍）加灭菌生理盐水1ml混匀，12 000转／分钟离心5分钟。
③去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
④12 000转／分钟离心5分钟，备用。
胃黏膜组织
①用适量灭菌生理盐水清洗送检组织沾带的血液。
②取约50mg组织，加1ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
③去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
④12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（3） Hp阳性定量参考品处理：震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（Hp PCR反应液40μl／人份+Tag酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42.5 μl／管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2. 5μl，直接加入阳性定量参考品2.5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择Hp的程序，点击窗口右下角的 ，核对Hp反应程序（93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Tar-gets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“ApplyTemplate”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Tem-plates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在 左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。
 
再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的
，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在1.0×106～2.0×107基因拷贝／ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在2.0×102～2.0×104基因拷贝／ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1或r2≥0. 985。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的Hp DNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
a）若样品的C＜5.0×102基因拷贝／ml，则漱口水、胃液样品的Hp DNA总含量＜5.0×102基因拷贝/ml，组织的HpDNA含量＜5.0×102基因拷贝。
b）若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，则漱口水、胃液样品的HpDNA总含量=C基因拷贝／ml，组织的Hp DNA含量=C基因拷贝。
c）若样品的C＞5. 00E+008，则漱口水、胃液样品的Hp DNA总含量为＞5.0×108基因拷贝／ml，组织的Hp DNA含量＞5.0×108基因拷贝。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品的灵敏度为5.0×102基因拷贝／ml，线性范围为5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。
【临床意义】
HSV-2则是生殖器疱疹的主要病原体（90%），存在于皮肤和黏膜损害的渗出液、精液、前列腺分泌液、宫颈和阴道分泌液中，主要通过性交传染，引起原发性生殖器疱疹。原发性生殖器疱疹消退后，残存的病毒经周围神经沿神经轴长期潜存于骶神经节，当机体抵抗力降低或某些激发因素如发热、受凉、感染、月经、胃肠功能紊乱、创伤等作用下，可使体内潜伏的病毒激活而复发。检测生殖泌尿道分泌物、生殖道刮片等样本受感染细胞中单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型DNA，对诊断是否有该病毒的感染有重要的参考价值。可用于单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型感染患者药物治疗的疗效监控。
【标本要求】
1.种类生殖泌尿道分泌物棉拭子、尿道口或患病部位刮片等。
2.标本取样量及保存方法
（1）男性生殖泌尿道分泌物棉拭子：用细小无菌无病毒的棉拭子伸入尿道约2～4cm，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌管中，密闭送检（采集分泌物前2小时禁小便）。
（2）女性生殖道分泌物棉拭子：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭子采集宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌管中，密闭送检。
（3）女性尿道分泌物棉拭子：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2cm，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。
（4）尿道口或患病部位刮片：用刮片刮取宫颈病灶处脱落细胞，置入无菌管中，密闭送检。
（5）标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法 实时荧光定量PCR检测法。
2.原理 用一对单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型特异性引物和一条单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型DNA。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司单纯疱疹病毒（HSV）Ⅱ型（HSVⅡ）核酸扩增荧光定量检

组分名称
规格
数量
DNA提取液
HSVⅡPCR反应液
Taq酶
500μl／管
400μl管
60μl／管
2
2
1

续表

组分名称
规格
数量
阴性质控品
HSVⅡ弱阳性质控品
HSVⅡ强阳性质控品
HSVⅡ阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）红色
HSVⅡ阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝／ml）黄色
HSVⅡ阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/ml）蓝色
HSVⅡ阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝/ml）绿色
150μl／管
200μl／管
200μl／管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
1
1
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性质控品处理。
（2）取出阴性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（3）标本处理
1）生殖泌尿道分泌物棉拭子
①向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子。
②吸取全部液体转至1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
③去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12 000转／分钟离心5分钟。
④去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
⑤12 000转／分钟离心5分钟，备用。
2）尿道口或患病部位刮片：向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀；
以下处理同上。
（4） HSVⅡ弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（5） HSVⅡ强阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（6） HSVⅡ阳性定量参考品处理震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（HSVⅡPCR反应液40μl／人份+Taq酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42.5μl/管分装至LightCy-cler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2.5μl，直接加入阳性定量参考品2.5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择HSVⅡ的程序，点击窗口右下角的 ，核对HSVⅡ反应程序（93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experi-ment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Tem-perature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在NoiseBand中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。再点击进入 ，点击软件界面中间偏右能 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长的曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
 
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在1.0×106～2.0×107基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在2.0×102～2.0×104基因拷贝/ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1或r2≥0. 985。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的HSVⅡDNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
a）若样品的C＜5. 00E+002，样品HSVⅡDNA总含量＜5.0×102基因拷贝／ml。
b）若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，样品HSVⅡDNA总含量一C基因拷贝/ml。
c）若样品的C＞5. 00E+008，样品HSVⅡDNA总含量＞5.0×108基因拷贝／ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品的灵敏度为5.0×102基因拷贝/ml，线性范围为5.0×102～5.0×108基因拷贝／ml。主要高危型HPV与本试剂盒无交叉反应。
【临床意义】
肺炎支原体（Mycoplasma pneumomae，MP）是通过飞沫及经人传入传播，引起呼吸道感染的一种病原体，主要引起间质性肺炎（非典型性肺炎）哮喘及支气管炎。也可引起肺外并发症，如脑膜炎、脑干炎、脊髓炎、心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等。多发夏秋季节。肺炎支原体是目前成人和儿童呼吸道感染的主要病原体之一，而且其感染率有逐年上升的趋势。支原体有很强的传染性，可引起散发或小范围内流行，常引起集体感染，例如幼儿园、学校、社区等。也常常在家庭成员中交叉传染，导致久治不愈。
肺炎支原体核酸检测由于敏感性高，对诊断肺炎支原体感染有很重要的参考价值，也是对其他检测系统的补充，可以做到早期辅助诊断，最大限度地避免漏检。有助于临床有针对性地采取治疗措施，使患者的病情尽快好转。及早治疗，预防传播。肺炎支原体核酸检测也可对其感染患者进行药物治疗的疗效监控。
【标本要求】
1.种类痰液、肺及支气管灌洗液、咽拭子等。
2.标本取样量及保存方法
（1）痰液——用无菌5ml玻璃管取受检者肺深部咳出痰液1～3ml，密封送检；婴幼儿用密闭容器与无菌吸痰器相连，吸取痰液，密封送检。
（2）肺及支气管灌洗液——用无菌5ml玻璃管收集灌洗液1～3ml，密封送检。
（3）咽拭子——用棉拭子取咽部分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密封送检。
（4）标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月，标本运送采用0℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法 实时荧光定量PCR检测法。
2.原理 用一对肺炎支原体（MP）特异性引物和一条肺炎支原体（MP）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法定量检测肺炎支原体（MP） DNA。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司肺炎支原体（MP）核酸扩增荧光定量检测试剂盒

组分名称
规格
数量
DNA提取液
MPPCR反应液
Taq酶
阴性质控品
MP弱阳性质控品
MP强阳性质控品
MP阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/ml）红色
MP阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝／ml）黄色
MP阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝／ml）蓝色
MP阳性定量参考品（1.0×107基因拷贝／ml）绿色
500μl/管
400μl／管
60μl／管
50μl／管
50μl／管
50μl／管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
10μl/管
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1

【操作步骤】
1.DNA提取
（1）阴性质控品处理。
（2）取出阴性质控品，8000转／分钟离心数秒，吸50μl～0. 5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟；12 000转／分钟离心5分钟，备用。
（3）标本处理
1）痰液
①痰液中加入4倍体积的生理盐水，轻轻震荡后置4℃冰箱过夜。
②用吸头或吸管混匀后吸取1～1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
③去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理（10±1）分钟。
④12 000转／分钟离心5分钟，备用。
2）肺及支气管灌洗液
①取灌洗液1. 0～1. 5ml离心管，12，000转／分钟离心5分钟。
②去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12 000转／分钟，离心5分钟。
③去上清，以下处理同上。
3）咽拭子
①向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子。
②吸取全部液体转至1. 5ml离心管中，12 000转／分钟离心5分钟。
（4） MP弱阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（5）MP强阳性质控品处理（同阴性质控品）。
（6） MP阳性定量参考品处理震荡混匀，8000转／分钟离心数秒，备用。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（MP PCR反应液40μl／人份+Taq酶3μl／人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按42. 5μl/管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）上清液2. 5μl，直接加入阳性定量参考品2. 5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择MP的程序，点击窗口右下角的 ，核对MP反应程序（93℃2分钟；93℃12秒→57℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Tar-gets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Tem-plates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。Error＜0.2；Efficiency:1. 8～2.1为有效。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且强阳性质控品定量参考范围在1.0×106～2.0×107基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考范围在2.0×102 ～2.0×104 基因拷贝/ml范围。
（3）阳性定量参考品：增长曲线呈S形曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1或r2≥0. 985。
（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果增长曲线不呈S形曲线或Ct值空白，则判样品的MP DNA总含量小于检测极限。
（2）如果增长曲线呈S形曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
a）若样品的C＜5.00E+002，则咽拭子样品的MP DNA总含量＜5.0×102基因拷贝，灌洗液标本的MP DNA含量为＜5.0×102基因拷贝/ml，痰液的MPDNA含量＜2.5×103基因拷贝／ml。
b）若样品的5.00E+002≤C≤5.00E+008，则咽拭子样品的MP DNA总含量=C基因拷贝，灌洗液标本的MP DNA含量为=C基因拷贝／ml，痰液的MP DNA含量=5.0×C基因拷贝／ml。
c）若样品的C＞5. 00E+008，则咽拭子样品的MP DNA总含量为＞5.0×108基因拷贝，灌洗液标本的MP DNA含量为＞5.0×108基因拷贝／ml，痰液的MP DNA含量＞2.5×109基因拷贝／ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
【性能参数】
处理后样品的灵敏度为5.0×102基因拷贝／ml，线性范围为5.0×102 ～5.0×108基因拷贝／ml。
【临床意义】
结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。肺部感染由于感染菌的毒力、数量、机体的免疫状态不同，肺结核可有以下两类表现：
1.原发感染 多发生于儿童。初次感染的机体因缺乏特异性免疫，结核分枝杆菌常经淋巴管到达肺门淋巴结，引起肺门淋巴结肿大，称原发综合征。此时，可有少量结核分枝杆菌进入血液，向全身扩散，但不一定有明显症状（称隐性菌血症）；与此同时灶内巨噬细胞将特异性抗原递呈给周围淋巴细胞。感染3～6周，机体产生特异性细胞免疫，同时也出现超敏反应。病灶中结核分枝杆菌细胞壁磷脂，一方面刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞，后者相互融合或经核分裂形成多核巨细胞（即朗格汉斯巨细胞），另一方面抑制蛋白酶对组织的溶解，使病灶组织溶解不完全，产生干酪样坏死，周围包着上皮样细胞，外有淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，形成结核结节（即结核肉芽肿）是结核的典型病理特征。感染后约5%可发展为活动性肺结核，其中少数患者因免疫低下，可经血和淋巴系统，播散至骨、关节、肾、脑膜及其他部位引起相应的结核病。90%以上的原发感染形成纤维化或钙化，不治而愈，但病灶内常有一定量的结核分枝杆菌潜伏，不但能刺激机体产生免疫也可成为日后内源性感染的祸根。
2.继发感染 亦称复活感染，病灶亦以肺部为多见。病菌可以是外来的（外源性感染）或原来潜伏在病灶内（内源性感染）。由于机体已有特异性细胞免疫，因此继发感染的特点是病灶多局限，一般不累及邻近的淋巴结，被纤维素包围的干酪样坏死灶可钙化而痊愈。若干酪样结节破溃，排入邻近支气管，则可形成空洞并释放大量结核分枝杆菌至痰中。
【标本要求】
1.标本采集 以清晨第一口痰为宜。先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管中，密封，即可送检，合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样性质的痰液，痰量以3～5ml为宜。
2.样本预处理
（1）取痰液1.5ml，视痰标本性状加入1～2倍体积的4%NaOH于无菌样品管中，涡旋振荡1分钟，使痰液充分匀化，室温放置15～20分钟。
（2）样品处理管（1.5ml离心管，数量为：待测样本数+2），分别标记待处理样品编号及阳性、阴性对照。
（3）取液化好的痰液标本1ml于样品处理管中，13 000转／分钟离心5分钟，弃上清，该样本即为待测样本。
（4）加入1ml生理盐水重悬洗涤，13 000转／分钟离心5分钟，弃上清，加入50μl TB稀释液重悬。
3.保存 采集的样本在2～8℃保存不超过7天（建议不超过24小时）。待测样本（2.3中的沉淀物）在2～8℃保存不超过3天，-20℃或者-70℃冷冻保存3个月。
4.运输 密封冷藏（2～8℃）运输。
【方法与原理】
本试剂盒的结核分枝杆菌核酸检测分为核酸提取和恒温扩增检测。
在核酸提取过程中，细菌经超声破碎裂解释放出核酸RNA。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification andTesting，SAT）使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从双链DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照和阴性对照对检验结果进行判定。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）、超声波仪。
【试剂】
上海仁度生物科技有限公司结核分枝杆菌（TB）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
试剂组成：

组成成分
包装盖颜色
规格
TB稀释液
TB检测液
SAT酶液
TB反应液
TB阳性对照
TB阴性对照
白
棕
紫
黄
红
绿
2×1.0ml
1×40μl
1×200μl
1×600μl
1×50μl
1×50μl

（1） TB稀释液：含RNase抑制剂的溶液。
（2） TB检测液：含TB特异引物、特异荧光探针。
（3）SAT酶液：含反转录酶，T7聚合酶。
（4） TB反应液：含dNTPs、NTPs和扩增所需组分。
（5） TB阳性对照：含灭活的结核分枝杆菌菌液。
（6） TB阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。
【操作步骤】
1.试剂准备 按照每人份30μlTB反应液+2μl TB检测液配制扩增检测液，混匀离心备用。
2.核酸提取
（1）阳性对照：取2μl阳性对照加入198μl TB稀释液中，混匀备用。
（2）阴性对照：取2μl阴性对照加入198μl TB稀释液中，混匀备用。
（3）将50μl样本及50μl（1）中制备的阳性对照，50μl（2）中的阴性对照放入超声波清洗器中进行超声处理1 5分钟，超声功率为300W。
（4）超声结束后，取2μl处理物加入含30μl扩增检测液的洁净微量反应管中。
（5）60℃温浴10分钟，再42℃温浴5分钟，然后每孔加入42℃预热好的SAT酶10μl。
3.上机扩增 提前打开核酸扩增仪并设置扩增程序（42℃，40分钟，每分钟采一次荧光，选取FAM通道）。加好酶后要马上放入核酸扩增仪进行扩增。
4.质量控制
（1）应用临界弱阳性对照进行实验室质控：为了防止出现漏检（假阴性）的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
a）临界弱阳性对照的制备方法：将TB阳性对照用TB稀释液作10000倍稀释，即为临界弱阳性对照。
b）临界弱阳性对照的使用方法：取50μl临界弱阳性对照，放入超声波清洗器中进行超声处理15分钟，超声功率为300W，超声结束后，取2μl处理物加入含30μl扩增检测液的洁净微量反应管实验。
（2）质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的检测时间（detection time，dt）应满足以下条件：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40；否则，实验视为无效需重新进行。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的Ct值类似）。
5.结果判定
（1）阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
（2）结果判断
1） dt≤35的样本为阳性。
2）35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性。
3） dt无数值或为40的样本为阴性。
【参考范围】
通过对本试剂盒的最低检测下限浓度TB菌（1CFU/反应）进行大量实验统计分析，并结合正常人样本和临床阳性样本的检测数据，确定95%置信区间为：dt值≤35.99%置信区间的dt值范围为：dt＜40。
【临床意义】
沙眼衣原体（CT）所引起的生殖道感染已成为最常见的性传播疾病，且仍有上升趋势，常与淋病奈瑟菌混合感染。沙眼衣原体可导致尿道炎、附睾炎、Reiter综合征、子宫颈炎、盆腔炎、直肠炎、眼结膜炎。沙眼衣原体上行感染子宫内膜、输卵管，引起盆腔炎（PID）、不育及异位妊娠（也称宫外孕）等。其中，由母亲垂直传播给新生儿的感染率可达60%～70%。感染沙眼衣原体的妇女怀孕后在妊娠和分娩过程中发生流产、早产、胎膜早破、低体重儿等危险的几率会大大增加。
检测沙眼衣原体有助于对泌尿系统疾病和生殖系统疾病的诊断，及早诊治，及时治疗，控制传播。还可以对沙眼衣原体感染患者进行临床疗效评价。疗效评价通常在治疗7～10天，第一次评价后1～2周及完成治疗后4～6周进行。
【标本要求】
1.标本采集
（1）尿样标本：取清晨首次尿，或长时间（至少1小时）不排尿后的首段尿0. 5ml，与0.5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
（2）拭子标本：将医用棉拭子伸入男性尿道口或女性宫颈口约1～2cm，旋转1周，停留10秒钟后取出，放入1ml生理盐水浸泡，然后贴管壁挤干，取0.5ml加入0. 5ml尿样保存液混合，该样本即为待测样本。
2.保存待测样本在2～8℃保存不应超过30天，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，应避免反复冻融。
3.运输 密封冷藏（2～8℃）运输。
【方法与原理】
本试剂盒的沙眼衣原体核酸检测分为核酸提取和恒温扩增检测。
在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸（RNA）。
实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Tes-tlng，SAT）使用M-MLV反转录酶、T7 RNA多聚酶和优化探针技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从双链DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。
检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照和阴性对照对检验结果进行判定。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）、磁力架、电动吸引器。
【试剂】
上海仁度生物科技有限公司沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）
试剂组成：

组成成分
包装盖颜色
规格
尿样保存液
核酸提取液
洗涤液
CT反应液
CT检测液
SAT酶液
CT阳性对照
CT阴性对照
白
白
白
黄
棕
紫
红
绿
1×10ml
2×1ml
1×40ml
1×800μl
1×50μl
1×200μl
1×50μl
ixsoui

（1）尿样保存液：含去垢剂，用于保存细菌RNA。
（2）核酸提取液：含捕获探针和磁性颗粒，用于结合病原体RNA。
（3）洗涤液：含SDS。
（4） CT反应液：含dNTPs、NTPs和扩增所需组分。
（5）CT检测液：含CT特异引物、特异荧光探针。
（6） SAT酶液：含逆转录酶，T7聚合酶。
（7）CT阳性对照：含CT RNA。
（8）CT阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。
【操作程序】
1.试剂准备 按照每人份40μl反应液+2. 5μl检测液配制扩增检测液，混匀备用。
2.核酸提取
（1）取400μl已加好尿样保存液的标本（阴阳对照的做法是200μl生理盐水+200μl尿样保存液+10μl对照），加入100μl核酸提取液。震荡，60℃温浴5分钟，再室温放置10分钟。
（2）将其放在磁力架上，吸附磁珠5分钟。待磁珠吸附到管壁一侧后，用真空泵吸走废液。然后加入1ml洗涤液，震荡混匀，继续吸附。吸附好后，再次吸走废液。再重复洗涤一次。
（3）最后一次要尽量吸干净废液，然后向其中加入步骤1中配好的扩增检测液40μl，震荡，让磁珠悬浮其中。然后转移30μl到微量反应管中。60℃温浴10分钟，然后再42℃温浴5分钟。然后每孔加入42℃预热好的SAT酶10μl。
3.上机扩增 提前打开核酸扩增仪并设置扩增程序（42℃，40分钟，每分钟采一次荧光，选取FAM通道）。加好酶后要马上放入核酸扩增仪进行扩增。
4.质量控制
（1）应用临界弱阳性对照进行实验室质控：为了防止出现漏检（假阴性）的情况，SAT检测实验室应定期应用临界弱阳性对照进行室内质量控制。
a）临界弱阳对照的制备：取生理盐水和尿样保存液按照1:1混合作为稀释液，将试剂盒提供阳性对照品（105 copies/反应）稀释100倍即为临界弱阳性对照（103 copies/反应）。
b）临界弱阳性对照的使用方法：取0. 2ml生理盐水加入0.2ml尿样保存液中，混匀后加入10μl临界弱阳性对照，混匀备用；样本处理和检测过程同阳性对照和阴性对照。
（2）实验质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的检测时间（detection time，dt）值应满足以下条件：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40；否则，实验视为无效，需重新进行。
注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的Ct值类似）。
5.结果判定
（1）阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。
（2）结果判断
1） dt≤35的样本为阳性。
2）35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性。
3）dt无数值或为40的样本为阴性。
【参考范围】
通过对检测下限浓度RNA大量实验统计分析，并结合体检者样品和阳性样品的实验数据，确定95%覆盖下dt≤35.99%覆盖下dt＜40。
【临床意义】
肠道病毒通用型（EV）感染可导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿等症状或并发症，严重者可导致死亡。采用实时荧光RT-PCR方法，对粪便、咽拭子、疱疹液样本中的EV核酸进行定性检测对EV感染的诊断有重要的参考价值。
【标本要求】
1.种类 粪便、咽拭子、疱疹液等。
2.标本取样量及保存方法 样本采集对象为手足口病、疱疹性咽峡炎等患者或疑似患者，特别是发病所在地的社区或托幼机构的5岁以下的儿童。
（1）粪便样本：采集患者发病7日内的粪便样本，粪便样本采集量每份5～8g，采集后立即放入无菌采便管内。
（2）咽拭子样本：采集患者发病3日内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。
（3）疱疹液：可同时采集多个疱疹作为一份样本。先用75%酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。
（4）标本保存和运送：样本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为4个月；长期保存，请置于-70℃；临床样本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，样本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如样本编号、发病日期和样本采集日期。
【方法与原理】
1.方法 荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，以EV基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增对EV RNA进行定性检测。临床样本使用商业化核酸提取试剂进行RNA提取后，以试剂盒中提供的PCR检测试剂配制成PCR反应管。将核酸加入PCR反应管中，使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值（Ct值）实现对未知样本的定性检测。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司肠道病毒通用型（EV）核酸扩增荧光检测试剂盒
试剂盒组成（不可拆分）：

组分名称
规格
数量
EVRT-PCR反应液
逆转录酶系
Taq酶系
阴性质控品
EV强阳性质控品
360μl/管
50μl／管
75μl管
300μl／管
300μl／管
1
1
1
1
1

【操作程序】
1.RNA提取 建议取200μl液态样本进行核酸提取。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸柱提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的阴性、阳性质控品均参与提取，分别用于对环境监控和PCR检测试剂的质控。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：按比例（EV RT-PCR反应液15 μl／人份十逆转录酶系2μl／人份+Tag酶系3μl/人份）取相应量的RT-PCR反应液、逆转录酶系及Taq酶系，充分混匀后按20μl／管分装至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、阳性质控品）上清液5μl，3000转／分钟离心30秒，放入仪器样品槽。（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择EV的程序，点击窗口右下角的 ，核对EV反应程序（40℃25分钟；94℃3分钟；93℃2分钟；93℃15秒→55℃45秒（收集荧光）→40个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名，点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“TemperatureTargets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Tem-plate”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择未知标本、阳性对照／阴性对照 。
 
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图；再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。
3.质量控制
（1）阴性质控品：增长曲线不呈S形曲线或Ct值为空白。
（2）阳性质控品：增长曲线呈S形曲线，且阳性质控品Ct＜30。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果检测样本无典型S形扩增曲线或Ct值＞34.9，则判样本为EV阴性。
（2）如果检测样本呈典型S形扩增曲线且Ct值≤34.9，则判样本为EV阳性。
通过临床试验结果分析，利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的参考范围为Ct值等于35.1。试剂盒灵敏度：使用CCID50标定法为5.0×102 CCID50/0.1ml；使用空斑计数法为2.0×103 PFU/ml。与感染部位相同或感染症状相似的其他病毒（肠道病毒71型、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、轮状病毒、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒等）无交叉反应。
【临床意义】
用于定性检测呼吸道样本中甲型H1N1流感病毒核酸，可用于该病毒感染的实验室诊断和监控。
【标本要求】
1.种类 咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道样本。
2.标本取样量及保存方法 请参照卫生部发布的《甲型H1N1流感监测方案（第一版）》及相应的附录3《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案（试行）》的要求。遵循目前的流感标本采集方案以及标准的流感标本储存、包装和运送标准和相应的国际航空运输协会的规定。
【方法与原理】
1.方法 实时荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，分别以甲型H1N1流感病毒HA和NA两个基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增甲型H1N1流感病毒基因组的RNA进行H1型和N1型的定性检测。另外，通过内标物质对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0. 5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
中山大学达安基因股份有限公司甲型H1N1流感病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒
试剂盒组成（不可拆分）：

组分名称
规格
数量
核酸提取试剂
离心柱
24个／包
1
收集管
96个／包
1
病毒裂解液
5.5ml/瓶
1
抑制物去除液（浓缩液）
7.5ml／瓶
1
去离子液（浓缩液）
5.5ml／瓶
1
洗脱液
3ml／瓶
1
蛋白酶K（干粉）
—
1
CarrierRNA（干粉）
—
1
PCR检测试剂
IVAH1引物探针混合液
25μl／管
1
IVAN1引物探针混合液
25μl／管
1
一步法RT-PCR反应液
250μl/管
1
一步法RT-PCR反应酶系
150μl／管
1
DEPC H2O
2000μl／管
1
内标溶液
150μl／管
1
质控品
阴性质控品
200μl／管
2
IVAH1N1阳性质控品
200μl／管
2

【操作程序】
1.RNA提取使用商品化的试剂盒或按照以下步骤操作。标本（含阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）
（1）实验前准备
1）抑制物去除液（浓缩液）中加入5ml的无水乙醇，并在管盖上打钩。室温保存。
2）去离子液（浓缩液）中加入22ml的无水乙醇，并在管盖上打钩。室温保存。
3）蛋白酶K（干粉）中加入1. 375ml的洗脱液，充分混匀，溶解。- 20℃保存。
4）Carrier RNA（干粉）中加入110μl的内标溶液，充分混匀，溶解。- 20℃保存（Carrier RNA为白色或半透明物质，请仔细检查，确保其完全溶解）。
注：①如将病毒裂解液、抑制物去除液不恰当地放置在低温时，可能会出现结晶沉淀。37℃温育至其消失即可。
②使用前须将5ml裂解液与100μl Carrier RNA混合（25人份用量），颠倒10次，充分混匀（最好现配现用）。
（2）样本处理与RNA提取
1）液态标本处理（含阴性质控品、鼻咽分泌物、IVA H1N1阳性质控品）
a）在1. 5ml的无菌离心管内加入50μl的蛋白酶K。
b）取液态样本200μl加入离心管中（待测样本不足200μl时请补加适量生理盐水重悬）。
c）再加入200μl的病毒裂解液（已含Carrier RNA），盖紧管盖，漩涡振荡15秒以充分混匀，高速离心10秒（防止温育时产生气泡），72℃10分钟。同时可将洗脱液置于72℃预热。
d）加入250μl无水乙醇，振荡15秒。
e）将混合液全部吸至离心柱，室温下12 000转／分钟离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。
f）将500μl的抑制物去除液加入离心柱，室温下12 000转／分钟离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。
g）将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12 000转／分钟离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。
h）再次将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12 000转／分钟离心1分钟，将离心柱装至新的收集管。
i）将离心柱-收集管于室温下最大转速离心3分钟以除去残余的乙醇。
j）将离心柱取出，放置于新的1. 5ml离心管。打开离心柱盖子，72℃放置2分钟（使用于式恒温器，不能使用水浴锅）。
k）在离心柱的膜的正上方小心加入72℃预热的洗脱液50μl，盖紧离心柱管盖，室温静置1分钟后，最大转速离心1分钟。离心管内即为病毒核酸溶液，建议立即使用，如需保存，置于-20℃。
2）咽拭子等拭子类标本处理：咽拭子等标本须在运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上黏附的病毒及含有病毒的细胞等，后续处理同液态标本处理操作。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：分别配制甲型流感病毒（IVA） H1 RT-PCR反应体系和IVANl RT-PCR反应体系：取N个（N=阴性质控品+2×待测样本个数十阳性质控品）PCR反应管（按Hl和Nl两种反应体系计算）；每管分别加入一步法RT-PCR反应液5μl、一步法RT-PCR反应酶系3μl、IVA H1引物探针混合液1μl，加DEPC H2O补足至20μl（也可按照单个反应的用量，计算一步法RT-PCR反应液、一步法RT-PCR反应酶系、IVA H1或N1引物探针混合液、DEPC水各自所需总量，三者混匀后分装20μl于单个PCR反应管中）；IVA N1一步法RT-PCR反应体系配制时将上述步骤中的IVA Hl引物探针混合液改为IVAN1引物探针混合液，其他步骤相同。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）浊液5μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择H1N1的程序，点击窗口右下角的 ，核对H1N1反应程序（50℃15分钟，1个循环；95℃15分钟，1个循环；94℃15秒→58℃45秒（收集荧光），40个循环；探针模式为FAM和VIC双探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 立用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照
（5）实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Sub-set（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在NoiseBand中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图。再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。
 
3.质量控制
（1）阴性质控品：FAM检测通路荧光信号无增长，且无明显S形扩增曲线。
（2）强阳性质控品和临界阳性质控品：FAM荧光信号增幅明显，且扩增曲线呈典型S形扩增曲线。且强阳性质控品Ct值在9～12范围，临界阳性质控品Ct值在17～20范围。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果检测样品的H1及N1 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM检测通道无对数增长期或Ct值＞37，且在Vic检测通道有对数增长期，可判样品为甲型流感病毒H1N1阴性。
（2）如果检测样品的H1及N1 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM，Vic检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤35；或扩增曲线在FAM检测通道有对数增长期且Ct值≤35，在Vic检测通道无对数增长期，可判样品为甲型流感病毒H1N1阳性。
（3）如果检测样品H1及N1 RT-PCR反应体系的扩增曲线在Vic检测通道有对数增长期，且在FAM检测通道35＜Ct值≤37，需要对样品重新进行核酸提取和检测操作，若再次实验结果FAM检测通道Ct值≤35，且曲线有明显对数增长期，判样品为甲型流感病毒H1N1阳性；若FAM检测通道Ct值＞35，可判样品为甲型流感病毒H1N1阴性。
（4）如果检测样品的H1或N1 RT-PCR反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求，则需重复检测；若重复检测结果仍为H1（或N1）阳性，则只可判为甲型流感病毒H1（或N1）型阳性。
【参考范围】
确定本试剂盒的阳性样本参考范围为FAM检测通道Ct值≤35，阴性样本参考范围为FAM检测通道Ct值＞37，FAM检测通道35＜Ct值≤37为灰度区。根据产品分析性能评估结果，本试剂盒的灵敏度为1.0×103 PFU/ml。
【临床意义】
人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染不仅引起肉眼所见的尖锐湿疣，而且与宫颈上皮内瘤变（CIN）、宫颈癌发生、发展密切相关，久治不愈。到目前为止，已发现和鉴定出超过100种不同类型的HPV，有54种可以感染生殖道黏膜。依据HPV与癌瘤的关系，感染肛门生殖器的HPV可归类为低度危险、中度危险和高度危险型。低危型HPV常常在良性或轻度不典型增生病灶中检测到，而很少存在于癌灶中，如HPV6、11型与外生殖器和肛周区域的外生型湿疣关系密切。中危型HPV存在于中重度不典型增生病灶中，很少存在于癌灶中。高危型HPV则通常在重度不典型增生和癌灶中，如HPV16、18型可在大多数宫颈癌、一些肛管癌、阴茎癌和阴道癌中检测到。通过对HPV的检测，可反映病毒复制情况和水平，主要用于宫颈癌前的筛查，判断预后。并可监测病毒的疗效。
【标本要求】
1.种类 宫颈分泌物。
2.取量 分泌物拭子管（加0. 4ml的生理盐水）。
3.保存 分泌物拭子可2～8℃保存24小时，-20℃保存12个月对结果无影响。
【方法与原理】
1.方法 双色荧光聚合酶链式反应：简称PCR（Polymerase Chain Reaction）
2.原理 试剂采用了双色荧光探针，对体外特异性靶基因扩增后，可实时分型定量。此试剂是国际首个HPV病毒同时分型和定量的检测试剂盒。它可以进行高效率的单管多型别双检，同时检测多种型别。该试剂也是目前唯一采用世界卫生组织确认的β-球蛋白基因（β-globin gene）作为宫颈上皮细胞的国际标准内标。β-球蛋白基因是一种存在于上皮细胞中的管家基因，可作为宫颈、尿道上皮细胞的身份证，它能有效地避免因临床取样未获得足够的宫颈上皮细胞而导致的实验结果假阴性问题。引入内标，可以比较不同标本或同一标本不同时间的病毒载量，是真实定量。通过采用国际内标和双探针技术，该试剂最后可实现同时对人体分泌物样品进行病毒载量的绝对定量和病毒的多型别检测。
3.分析范围 100～108 copies/μl。
4.干扰因素标本的溶血。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
意大利AB公司配套试剂
1.试剂包组成（不可拆分）实时混合液；引物混合反应液1，2，3；探针混合反应液1；HPV16和HPV18的DNA质粒；HPV31和HPV58的DNA质粒；β-球蛋白的DNA质粒。
2.其他试剂及耗材 反应管、吸头。
3.质控品。
4.校准品。
【操作程序】
1.DNA提取（生殖泌尿道分泌物棉拭子标本为例）
（1）向采集管中加入1.5ml灭菌生理盐水，充分震荡混匀，挤干棉拭子。
（2）吸取全部液体转移至1.5ml离心管中，13000转／分钟离心10分钟。
（3）去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液（DNA提取液使用品牌，请咨询深圳创强医疗器械有限公司），充分混匀。
（4）100℃水浴10分钟，13000转／分钟离心10分钟。
（5）取上清备用。
2.试剂配制 按如下表准备PCR反应液：

反应1
反应2
反应3
AB Real Time Mix 2X
Primer Mix 1
Probe Mix 1
Primer Mix 2
Probe Mix 2
10μl
0.4μl
0.8μl
 
10μl
 
 
0.4μl
0.8μl
10μl
 
 
 

续表

反应1
反应2
反应3
Primer Mix3
Probe Mix3
H2O
Volume finale
 
 
6.8μl
18μl
 
 
6.8μl
18μl
0.4μl
 
 

每个反应加2μl提取的样本DNA或阳性对照DNA。
3.PCR扩增加入模板后，用防光盖密封并压紧反应管，确保每一管底部不存在气泡，以4000转／分钟，离心至少2分钟。如果不能离心，确保移液管将所有的悬浮液转移到反应管底部。
反应温度参数：检测HPV DNA的PCR步骤分三步：

参数
数值
数值
数值
循环数
1
1
40
段
1
2
温度
50℃
95℃
94℃
57℃
孵育时间
2min
3min
15s
40s

基线调整取5～15个循环的荧光信号，阈值设置刚好超过阴性对照品最高点。
4.结果判定 扩增完待检样本检测Ct值＜38，且扩增曲线呈典型的S形，报告为阳性定量值；待检样本Ct值显示在38～40，建议重复测定。
当HPV定量值≥1E+2基因拷贝时，则判定该定量值（基因拷贝数）为此待测样本的定量值（基因拷贝数）。
当HPV定量值＜1E+2基因拷贝时，则判定此待测样本为阴性。
【参考范围】
≤100copies/μl。
【临床意义】
呼吸道合胞病毒感染症状主要包括咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉不适等呼吸道局部症状和发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等全身症状，婴幼儿常伴发热、气急，X线胸片常显示明显的支气管肺炎和（或）毛细支气管炎表现。在成人和年长儿，感染可能症状不明显或仅表现为无热性上呼吸道感染（普通感冒）。呼吸道合胞病毒核酸检测是RSV感染的辅助诊断。
【标本要求】
1.种类 鼻咽分泌物。
2.标本取样量及保存方法 吸取鼻咽分泌物，密封送检，标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为12个月，标本运送采用0℃冰壶。
【方法与原理】
1.方法 实时荧光定量PCR检测法。
2.原理 利用实时荧光PCR技术，以呼吸道合胞病毒基因组编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，通过进行一步法RT-PCR扩增对呼吸道合胞病毒RNA进行检测。
【仪器】
瑞士罗氏公司LightCycler480Ⅱ实时荧光核酸扩增仪、高速离心机、微型离心机、微量振荡器、旋涡混旋器、加样器（0.5～10μl、10～100μl、20～200μl）、金属浴（或水浴锅）。
【试剂】
1.中山大学达安基因股份有限公司呼吸道合胞病毒（RSV）核酸扩增荧光定量检测试剂盒
试剂盒组成（不可拆分）：

组分名称
规格
数量
RNA提取液A
RNA提取液B
DEPC H2O
RT-PCR反应管
RSV强阳性质控品
RSV临界阳性质控品
阴性质控品
100μl/管
4ml／瓶
1.5ml／管
单管单人份
100μl/管
100μl/管
200μl/管
1管
1瓶
2管
10管
1管
1管
1管

不同批号试剂盒以上成分不可以互换使用。
2.自备试剂 75%乙醇：按无水乙醇：DEPC水=3：1（体积比）配制。
【操作程序】
1.RNA提取：标本（含阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品）
（1）充分混匀RNA提取液A，吸取10μl/人份RNA提取液A加至1.5ml离心管中，然后再加入200μl RNA提取液B。
（2）取100μl待检样本或阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品至离心管中。
（3）充分振荡混匀，室温放置5分钟，8000转／分钟离心2分钟，弃上清。
（4）加入200μl RNA提取液B，吹打混匀，8000转／分钟离心2分钟，弃上清。
（5）加入4℃预冷的DEPC H2O配制的75%乙醇400μi，吹打混匀，8000转／分钟离心2分钟，弃上清。
（6）再加入4℃预冷的DEPC H2O配制的75%乙醇400μl，吹打混匀，8000转／分钟离心2分钟，弃上清，尽量吸去所有液体。
（7）打开管盖，65℃加热5分钟，使液体挥发完全。
（8）加入25μl DEPC H2O，吹打混匀管中沉淀，得到包含白色颗粒物的悬浊液，盖上管盖，冰上放置，用于RT-PCR检测。
2.PCR扩增
（1）试剂准备：取相应量的PCR管转移至LightCycler480Ⅱ的PCR反应管中，备用。
（2）加样：取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、弱阳性质控品和强阳性质控品）浊液10μl，8000转／分钟离心数秒，放入仪器样品槽。
（3）编辑程序：点击 ，在列表中选择RSV的程序，点击窗口右下角的 ，核对RSV反应程序（40℃30分钟；94℃3分钟；93℃15秒→55℃45秒10个循环；93℃15秒→55℃45秒（收集荧光）30个循环，探针模式为FAM探针），点击软件界面右下角的 ，输入实验文件名点击窗口右下角的 开始实验。或者点击右栏“New Experiment”，进入程序编辑界面：在“Programs”显示框下输入第一轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击左边“Programs”显示框下的 键，输入第二或第三轮温度循环的名称、循环数、分析类型，在屏幕中央的“Temperature Targets”编辑框中，按照试剂盒说明书指示设定各项温度时间参数；点击“Apply Template”下拉框中的“Save As Template”保存程序在“Templates/Run Templates”目录下，在跳出的对话框中输入测试项目名称保存。
（4）编辑样品：点击 ，点击左下角的 ，按Ctrl键的同时鼠标选择本次实验的孔，最后点击 应用（一次实验可以同时运行相同扩增参数的多个实验，可以分别设置多个子集）；先在Subset中选择本次实验的子集，点击左上角的 ，在左下角输入样品名称，再点击选择标准品类型和浓度、阳性对照／阴性对照 。
（5）结果分析：实验运行完成后进入 ，选择Abs Quant/Fit point，在窗口中的Subset（第二行）中选择本次实验的子集，点击软件界面中上方的 ，在Noise Band中调节Noise Band高度，使之处于对数增长期并高于所有噪音信号，如右图；再点击进入 ，点击软件界面中间偏右的 自动设置阈值或手工调节阈值（鼠标左键按住拖动或在 输入阈值大小），再点击软件界面左下角的 ，软件左下方出现每个样品的Ct值或浓度值等以及平均值标准误等信息，点击软件右上角的 为本次分析命名。
 
3.质量控制
（1）阴性质控品：FAM检测通路荧光信号无增长，且无明显S形扩增曲线。 （2）强阳性质控品和临界阳性质控品：FAM荧光信号增幅明显，且扩增曲线呈典型S形扩增曲线。且强阳性质控品Ct值在9～12范围，临界阳性质控品Ct值在17～20范围。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
4.结果判定
（1）如果FAM检测通路荧光信号无增长，且无典型S形扩增曲线，则判定RSV RNA浓度低于灵敏度。
（2）如果FAM荧光信号增幅明显，扩增曲线呈典型S形扩增曲线，且Ct值小于等于25. 97，则判定RSV RNA阳性。
（3）如果FAM荧光信号增幅明显，且扩增曲线呈典型S形扩增曲线，但Ct值大于25. 97，则认为该样品处于灰度区，需复检进行确定。
复检结果符合阳性判断结果或仍处于灰区的判为阳性。符合阴性判为阴性。
 
图2-5过氧化物酶通道
 
图2-6 嗜碱性粒细胞通道
 
图2-7 网织红细胞通道
 
图2-8 流式细胞术检测原理
 
图2-9 流式细胞术检测光学原理
 
图2-10 白细胞／嗜碱性粒细胞散点图
 
图2-11 白细胞分类散点图
 
图2-12 白细胞分类散点图
 
图2-13 有核红细胞散点图
 
图2-14 网织红细胞散点图
 
图2-15 血小板散点图（光学法）
 
图2-16 幼稚细胞散点图
 
图2-21 白细胞分类散点图
 
图2-22 尿液有形成分分布散点图
 
图2-23 血清IgG型抗A/B抗体效价检测（微柱法）
 
图2-24 间接抗人球蛋白试验（微柱法）
 
图2-25 直接抗人球蛋白试验（微柱法）
 
图2-26 游离抗体试验和释放抗体试验（微柱法）
 
图2-27 T淋巴细胞亚群（CD3／CD4/CD8）检测
 
图2-28 B淋巴细胞检测
 
图2-29 NK淋巴细胞检测

 



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