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【医技】检验科医疗诊疗规范——第三篇 临床微生物检验91-100

作者:王泓 日期:2014-06-19

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    【临床意义】
    柯萨奇病毒和埃柯病毒是无菌性脑膜炎的主要病原。柯萨奇病毒A组9型可引起无菌性脑膜炎瘫痪、皮疹、婴儿肺炎及肝炎等。柯萨奇病毒Bl至B6可引起胸膜痛、无菌性脑膜炎、心包炎、心肌炎等。
    埃柯病毒可引起无菌性脑膜炎、瘫痪、脑炎、共济失调、格林巴利综合征、呼吸道疾病等。另外埃柯病毒还可引起腹泻、流行性肌痛、心包炎、心肌炎、肝疾病等。
    肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型主要与手足口病有关。手足口病一种常见的皮肤病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，急性起病，发热；口腔黏膜出现散在疱疹，米粒大小，疼痛明显；手掌或脚掌部出现米粒大小疱疹，臀部或膝盖偶可受累。疱疹周围有炎性红晕，疱内液体较少。部分患儿可伴有咳嗽、流涕、食欲缺乏、恶心、呕吐、头疼等症状。该病为自限性疾病，多数预后良好，不留后遗症。极少数患儿可引起脑膜炎、脑炎、心肌炎、弛缓性麻痹、肺水肿等严重并发症。
    【标本要求】
    本检验项目涉及肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）、柯萨奇病毒A组16型（Coxsackie A16，CoxA16）、柯萨奇病毒B组（CoxB）及埃柯病毒（Echo）的培养及鉴定。
    标本以疱疹液、咽拭子和脑脊液为主。疱疹液标本采集方法有三种：①酒精消毒水疱表面后使用注射器抽取疱疹液，然后将抽取的疱疹液注入（涮洗入）3ml含抗生素及保护蛋白的运输液（viral transport medium，VTM）中；②酒精消毒水疱表面后用注射器针头刺破水疱，无菌拭子（意大利Copan公司产品，塑料粗杆拭子，这样可尽量多吸去标本）蘸取水疱液；③已经溃破的疱疹皮损可用无菌拭子擦吸基地部或溃疡面的疱疹液及感染细胞。咽拭子采集使用无菌拭子（意大利Copan公司产品，塑料粗杆拭子，这样可尽量多吸去标本）擦取患者的咽颊部标本。CSF标本由临床医生常规采集，标本量介于0.1～1ml均可，注射器滴（注射）入3ml的VTM中，同样在管上记录患者的ID。
    3ml的VTM倒入拭子管内，采样后的拭子标本立即放置其中，在管上记录患者的ID。所有采集后并置于VTM的标本应立即送至检验科病毒室，如不能，应将标本放置在2～8℃冷藏（请勿冷冻）保存，24小时内应送至病毒室。拭子管标本在运输过程中不可倒置，以免标本遗洒。
    【方法与原理】
    离心细胞培养技术（shell vial culture，SVC）及荧光标记的单克隆抗体直接染色法（direct fluorescent antibody，DFA）。通过物理离心力作用将标本中的可疑病毒颗粒（附着在细胞或碎片中）压挤附着在培养细胞上，从而大大提高病毒培养的敏感性，并缩短培养时间。通过荧光标记的单克隆抗体染色病毒增殖后的感染细胞，在免疫学及形态学两方面对其快速鉴定。
    【操作步骤】
    1.细胞培养
    （1）基本设备：美国Baker公司的A/B3生物安全柜（用于细胞和病毒培养）、Nikon公司TMS倒置显微镜、美国BECKMAN J6-MC离心机及配套的细胞培养板架。Olympus公司的X71倒置荧光显微镜和德国Heidolph公司 Paromax 2020型洗涤摇床等。
    （2）细胞株：人胚肺成纤维细胞（MRC-5）和人喉癌细胞（HEp-2）。细胞培养液为10%胎牛血清（美国HyClone公司）Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM，Sigma公司）培养基，含50μg/ml庆大霉素（Sigma公司）。
    （3）细胞传代及12孔板内单层细胞的设置：细胞传代为每周一和周五进行，具体为周1传代设置周3～5使用的细胞，周5传代设置下周1～2使用的细胞。
    （4）75cm2的培养瓶（美国Corning-Costar公司）内的MRC-5和HEp-2细胞生长成为单层细胞后，无菌0. 01mol／L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入2ml消化液（0.05%胰酶和0. 02%EDTA钠盐混合溶液），快速均匀覆盖细胞面后倾去多余的消化液，37℃温箱内消化10分钟，用10ml细胞生长液吹下细胞，并吹打数次再悬浮，取：
    a）周1传代设置
    MRC-5细胞
    ◆2ml细胞悬液+10ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留1ml+19ml细胞培养液（继续传代使用）
    b）周5传代设置
    MRC-5细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10.5ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留3ml+17ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    与细胞培养液混合后的稀释的细胞悬液按照每孔2ml的量种植于12孔细胞培养板内，MRC-5细胞种植在12孔板的第1和第3列（共计6孔），HEp-2细胞种植在12孔板的第2和第4列（共计6孔）。种植细胞的12孔板置于湿盒内并37℃温箱和5 %CO2培养。
    2.病毒培养
    （1）临床送达的病毒培养标本，如果24小时内能够接种，则放置2～8℃保存，否则冻存于-80℃冰箱内。
    （2）新鲜标本或自-80℃冰箱化冻的标本，接种前握拭子柄对标本管壁反复挤压拭子头，以便更多的可疑病毒标本挤入VTM，弃去拭子于消毒液内。如果为无拭子标本，仅将标本（VTM）混匀接种即可。
    （3）在12板标记需要接种的标本编号，用无菌塑料吸管吸去待接种孔内的细胞培养液，按照0. 5ml（VTM）／孔接种标本，每次接种设置阴性对照。每次更换培养液和（或）复苏新的细胞株时进行阳性质控，使用柯萨奇病毒B组（CoxB）阳性毒株（CAP室间质评标本，VRl-07，2009），阳性质控株单美国独接种一块12孔细胞培养板，不与临床标本接种同一块细胞培养板，以避免可能污染临床标本结果。
    （4）接种标本后的12孔细胞培养板进行离心培养，使用美国BECKMAN公司的J6-MC离心机，2000转／分钟，35℃离心60分钟。离心后的12孔细胞培养板置于35.5℃和5%CO2温箱吸附1小时，然后吸去接种物，加入病毒培养液（1%FBS DMEM培养基，含万古霉素50μlml，庆大霉素50μg／ml和二性霉素B 2.5μg／ml），病毒培养液加入量为每孔1.5～2ml，12孔细胞。
    （5）最终置于35.5℃和5% CO2温箱培养，每日观察细胞病变效应（cyto-pathic effect，CPE）。接种后3～4天更换病毒培养液1次。
    3.病毒培养鉴定
    （1）当病毒在培养细胞中生长时，可出现明显的CPE，表现为细胞肿胀变圆，折光性增强，有些呈葡萄串样改变，最终可见感染细胞死亡脱落。
    （2）一旦细胞出现明显的CPE应立即保存阳性培养物，并进行鉴定，使用间接荧光法（IFA）。保存阳性培养物：将CPE孔内的病毒培养液吸出后加入含1滴20% BSA溶液的2ml无菌管内并- 80℃冰箱保存。IFA鉴定：无菌0. 01mol／L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入3滴消化液，37℃消化10分钟，2ml细胞生长液再悬浮消化后的细胞并吸回至试管内，塑料吸管在试管内反复吹打数次，PBS洗涤2次（1000转／分钟离心3分钟）。最终0.5ml的PBS再悬浮，滴10孔玻片一张，保留剩余可疑感染细胞悬液备用。滴片后的玻片在生物安全柜内吹干，冷丙酮固定15分钟，取出后晾干。分别滴加抗肠道病毒单克隆抗体，滴加量约每孔10μi，均为美国LIGHT DIAGNOSTICSrM Chemicon Inter- national公司产品，现为Millipore公司。
    1）肠道病毒71型（Enterovirus 71）／柯萨奇病毒A组16型（CoxsackievirusA16）混合单克隆抗体。
    2）肠道病毒71型（Enterovirus 71）单克隆抗体。
    3）柯萨奇病毒B组（Coxsackievirus，CoxB）混合型单抗，涵盖柯萨奇病毒B组1、2、3、4、5和6型。
    4）埃柯病毒（Echovirus，Echo）混合型单克隆抗体，涵盖埃克病毒4、6、9、11、30和34型。
    5）泛肠道病毒单克隆抗体（Pan-Enterovirus），涵盖除上述病毒外，还包括脊髓灰质炎病毒1～3型、肠道病毒70型和柯萨奇病毒A组9型。
    （3）37℃湿盒内温育30分钟，PBS洗片2次，DW漂洗1次。晾干后滴加工作浓度的荧光标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，再次37℃湿盒内温育30分钟，PBS洗片2次，DW漂洗1次。晾干后封片甘油封片。荧光显微镜下观察结果。
   （4）接种后10天仍然未出现CPE的接种孔，仍然使用泛肠道病毒单克隆抗体（Pan-Enterovirus）IFA方法进行染色抗原检测，以防止极少数情况下有病毒培养生长，但产生的CPE不明显。操作方法同于出现CPE病变的培养孔。
    【参考范围】
    正常人群肠道病毒培养阴性。
    【临床意义】
    疱疹病毒皮损临床表现存在部位的差异，但单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和单纯疱疹病毒2型（HSV-2）在口唇和生殖器部位的感染存在的交叉，即约15%的生殖器疱疹由HSV-1所致，而少数口唇疱疹也可由HSV-2感染所致。上述任何疱疹病毒培养阳性均应考虑为致病病原体。
    【标本要求】
    本检验项目涉及巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）和带状疱疹-水痘病毒（VZV）的培养及鉴定。
    HSV及VZV标本以疱疹液（拭子）为主，如眼角膜、齿龈及咽颊部、口唇部、胸腰部和生殖会阴部等，其他标本的采集还有脑脊液标本（CSF）。疱疹液标本采集方法有三种，①一是酒精消毒水疱表面后使用注射器抽取疱疹液，然后将抽取的疱疹液注入（涮洗入）3ml含抗生素及保护蛋白的运输液（viral transport medium，VTM）中；②酒精消毒水疱表面后用注射器针头刺破水疱，无菌拭子（意大利Copan公司产品，塑料粗杆拭子，这样可尽量多吸去标本）蘸取水疱液；③已经溃破的疱疹皮损可用无菌拭子擦吸基地部或溃疡面的疱疹液及感染细胞。
    CMV培养标本包括尿标本、呼吸道标本（参见呼吸道病毒培养和鉴定章节）、支气管和肺泡灌洗液（BAL）及外周血单个核细胞（PBMC）。尿标本，为清洁中段尿标本，由于CMV经尿液排除是间断性过程，因此，多份尿标本可增加阳性检测率；呼吸道标本，以鼻拭子为主；PBMC尤其适用于免疫抑制患者，因为病毒室已开展敏感性和特异性良好的CMV pp65抗原血症检测项目，故该标本不作为主要选择。
    将3ml的VTM倒入拭子管内，采样后的拭子标本立即放置其中，在管上记录患者的ID。尿液标本1～2ml，滴加入含3ml的VTM管内，在管上记录患者的ID。CSF标本和BAL标本由临床医生常规采集，标本量介于0.1～1ml均可，注射器滴（注射）入3ml的VTM中，同样在管上记录患者的ID。
    所有采集后并置于VTM的标本应立即送至检验科病毒室，如不能，应将标本放置在2～8℃冷藏（请勿冷冻）保存，24小时内应送至病毒室。拭子管标本在运输过程中不可倒置，以免标本遗洒。
    【方法与原理】
    离心细胞培养技术（shell vial culture，SVC）和荧光标记的单克隆抗体直接染色法（direct fluorescent antibody，DFA）。通过物理离心力作用将标本中的可疑病毒颗粒（附着在细胞或碎片中）压挤附着在培养细胞上，从而大大提高病毒培养的敏感性，并缩短培养时间。通过荧光标记的单克隆抗体染色病毒增殖后的感染细胞，在免疫学及形态学两方面对其快速鉴定。
    【操作步骤】
    1.细胞培养
    （1）基本设备：美国Baker公司的A/B3生物安全柜（用于细胞和病毒培养）、Nikon公司TMS倒置显微镜、美国BECKMAN J6-MC离心机及配套的细胞培养板架。Olympus公司的X71倒置荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax 2020型洗涤摇床等。
    （2）细胞株：人胚肺成纤维细胞（MRC-5）和人喉癌细胞（HEp-2）。细胞培养液为10%胎牛血清（美国HyClone公司）Dulbecco's Modified Eagle Medium（D-MEM，Sigma公司）培养基，含50μg／ml庆大霉素（Sigma公司）。
    （3）细胞传代及12孔板内单层细胞的设置：细胞传代为每周一和周五进行，具体为周1传代设置周3～5使用的细胞，周5传代设置下周1～2使用的细胞。
    （4） 75cm2的培养瓶（美国Corning-Costar公司）内的MRC-5和HEp-2细胞生长成为单层细胞后，无菌0. 01mol／l。PBS.pH7.4洗涤细胞面2次，加入2ml消化液（0. 05%胰酶和0.02%EDTA钠盐混合溶液），快速均匀覆盖细胞面后倾去多余的消化液，37℃温箱内消化10分钟，用10ml细胞生长液吹下细胞，并吹打数次再悬浮，取：
    1）周1传代设置
    MRC-5细胞
    ◆2ml细胞悬液+10ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留1ml+19ml细胞培养液（继续传代使用）
    2）周5传代设置
    MRC-5细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留3ml+17ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    （5）与细胞培养液混合后的稀释的细胞悬液按照每孔2ml的量种植于12孔细胞培养板内，MRC-5细胞种植在12孔板的第2和第3列（共计6孔），HEp-2细胞种植在12孔板的第2和第4列（共计6孔）。种植细胞的12孔板置于湿盒内并37℃温箱和5%CO2培养。
    2.病毒培养
    （1）临床送达的病毒培养标本，如果24小时内能够接种，则放置2～8℃保存，否则冻存于-80℃冰箱内。
    （2）新鲜标本或自-80℃冰箱化冻的标本，接种前握拭子柄对标本管壁反复挤压拭子头，以便更多的可疑病毒标本挤入VTM，弃去拭子于消毒液内。如果是无拭子的疱疹液标本，仅将标本（VTM）混匀接种即可。
    （3）在12板标记需要接种的标本编号，用无菌塑料吸管吸去待接种孔内的细胞培养液，按照0. 5ml（VTM）／孔接种标本，每次接种设置阴性对照。每次更换培养液和（或）复苏新的细胞株时进行阳性质控，使用CMV病毒（CMV AD169株）和HSV-1病毒（SM44株）作为质控株，阳性质控株单美国独接种一块12孔细胞培养板，不与临床标本接种同一块细胞培养板，以避免可能污染临床标本结果。
    （4）接种标本后的12孔细胞培养板进行离心培养，使用美国BECKMAN公司的J6-MC离心机，2000转／分钟，35℃离心60分钟。离心后的12孔细胞培养板置于35.5℃和5%CO2温箱吸附1小时，然后吸去接种物，加入病毒培养液（1%FBS DMEM培养基，含万古霉素50μg/ml，庆大霉素50μg/ml和二性霉素B 2.5μg/ml），病毒培养液加入量为每孔1.5～2ml，12孔细胞最终置于35.5℃和5%CO2温箱培养，每日观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。接种后3～4天更换病毒培养液1次。
    3.病毒培养鉴定 当病毒在培养细胞中生长时，可出现明显的CPE，表现为细胞肿胀变圆，折光性增强，有些呈葡萄串样改变，最终可见感染细胞死亡脱落。
    （1）一旦细胞出现明显的CPE应立即保存阳性培养物，并进行鉴定，使用直接荧光法（DFA）。保存阳性培养物：将CPE孔内的病毒培养液吸出后加入含1滴20% BSA溶液的2ml无菌管内并- 80℃冰箱保存。DFA鉴定：无菌0.01moI/L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入3滴消化液，37℃消化10分钟，2ml细胞生长液再悬浮消化后的细胞并吸回至试管内，塑料吸管在试管内反复吹打数次，PBS洗涤2次（1000转／分钟离心3分钟）。最终0.5ml的PBS再悬浮，滴10孔玻片一张，保留剩余可疑感染细胞悬液备用。滴片后的玻片在生物安全柜内吹干，冷丙酮固定15分钟，取出后晾干。分别滴加荧光素标记的抗疱疹病毒的单克隆抗体，滴加量约每孔10μl，均为美国LIGHT DIAGNOSTICSTM Chemicon International公司产品，现为Millipore公司。
    1）巨细胞病毒（CMV）。
    2）单纯疱疹病毒1型（HSV-1）。
    3）单纯疱疹病毒2型（HSV-2）。
    4）带状疱疹-水痘病毒（VZV）。
    （2）37℃湿盒内温育30分钟，PBS洗片2次，DW漂洗1次。晾干后封片甘油封片。荧光显微镜下观察结果。
    （3）接种后10天仍然未出现CPE的接种孔，仍然使用上述荧光标记的抗疱疹病毒单克隆抗体DFA方法进行染色抗原检测，以防止极少数情况下有病毒培养生长，但产生的CPE不明显。操作方法同于出现CPE病变的培养孔。
    【参考范围】
    正常人群疱疹病毒培养阴性。
    【临床意义】
    由于呼吸道病毒感染具有相似的临床症状和体征，因此病原学诊断只能依靠实验室检测。上述任何呼吸道病毒培养阳性应考虑为致病病原体。
    【标本要求】
    本检验项目涉及甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒1型（PARAl）、副流感病毒2型（PARA2）、副流感病毒3型（PARA3）、副流感病毒4型（PARA4）、腺病毒（Aden）和呼吸道合胞病毒（RSV）培养及鉴定。
    标本为鼻拭子标本。拭子管为意大利Copan公司产品，分为两种，尼龙植绒头铝杆细拭子用于儿童，塑料粗杆拭子用于成人。标本采集方法是旋转拭子管柄（盖），取出无菌拭子，将拭子垂直于患者的面部插入一侧鼻孔至鼻腭部，并停留几秒钟，然后边慢慢旋转并拔除拭子。在拭子管内倒入3ml含抗生素及保护蛋白的运输液（viral transport medium，VTM），立即再将取样后的拭子标本放置其中，在管上记录患者的ID。采集后并置于VTM的拭子标本应立即送至检验科病毒室，如不能，应将标本放置在2～8℃冷藏（请勿冷冻），24小时内应送至病毒室。拭子管标本在运输过程中不可倒置，以免标本遗洒。
    【方法与原理】
    离心细胞培养技术（shell vial culture，SVC）和荧光标记的单克隆抗体直接染色法（direct fluorescent antibody，DFA）。通过物理离心力作用将标本中的可疑病毒颗粒（附着在细胞或碎片中）压挤附着在培养细胞上，从而大大提高病毒培养的敏感性，并缩短培养时间。通过荧光标记的单克隆抗体染色病毒增殖后的感染细胞，在免疫学及形态学两方面对其快速鉴定。
    【操作步骤】
    1.细胞培养
    （1）基本设备：美国Baker公司的A/B3生物安全柜（用于细胞和病毒培养）、Nikon公司TMS倒置显微镜、美国BECKMAN J6-MC离心机及配套的细胞培养板架。Olympus公司的X71倒置荧光显微镜和德国Heidolph公司Paromax 2020型洗涤摇床等。
    （2）细胞株：人胚肺成纤维细胞（MRC-5）和人喉癌细胞（HEp-2）。细胞培养液为10%胎牛血清（美国HyClone公司）Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM，Sigma公司）培养基，含50μg／ml庆大霉素（Sigma公司）。
    （3）细胞传代及12孔板内单层细胞的设置：细胞传代为每周一和周五进行，具体为周1传代设置周3～5使用的细胞，周5传代设置下周1～2使用的细胞。
    （4） 75cm2的培养瓶（美国Corning-Costar公司）内的MRC-5和HEp-2细胞生长成为单层细胞后，无菌0. 01mol/L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入2ml消化液（0. 05%胰酶和0.02%EDTA钠盐混合溶液），快速均匀覆盖细胞面后倾去多余的消化液，37℃温箱内消化10分钟，用10ml细胞生长液吹下细胞，并吹打数次再悬浮，取：
    1）周1传代设置
    MRC-5细胞
    ◆2ml细胞悬液+10ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供周3使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供周4使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供周5使用）
    ◆培养瓶保留1ml+19ml细胞培养液（继续传代使用）
    2）周5传代设置
    MRC-5细胞
    ◆1. 5ml细胞悬液+10. 5ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留3ml+17ml细胞培养液（继续传代使用）
    HEp-2细胞
    ◆1ml细胞悬液+11ml细胞培养液（供下周1使用）
    ◆0. 5ml细胞悬液+11. 5ml细胞培养液（供下周2使用）
    ◆培养瓶保留2ml+18ml细胞培养液（继续传代使用）
    （5）与细胞培养液混合后的稀释的细胞悬液按照每孔2ml的量种植于12孔细胞培养板内，MRC-5细胞种植在12孔板的第1和第3列（共计6孔），HEp-2细胞种植在12孔板的第2和第4列（共计6孔）。种植细胞的12孔板置于湿盒内并37℃温箱和5%CO2培养。
    2.病毒培养
    （1）临床送达的呼吸道病毒培养标本，如果24小时内能够接种，则放置2～8℃保存，否则冻存于-80℃冰箱内。
    （2）新鲜标本或自-80℃冰箱化冻的标本，接种前握拭子柄对标本管壁反复挤压拭子头，以便更多的可疑病毒标本挤入VTM，弃去拭子于消毒液内。
    （3）在12板标记需要接种的标本编号，用无菌塑料吸管吸去待接种孔内的细胞培养液，按照0. 5ml（VTM）／孔接种标本，每次接种设置阴性对照。每次更换培养液和（或）复苏新的细胞株时进行阳性质控，使用甲型流感病毒Al/京科／96-25（来自国家流感中心）和呼吸道合胞病毒ATCC VR1580作为质控株，阳性质控株单美国独接种一块12孔细胞培养板，不与临床标本接种同一块细胞培养板，以避免可能污染临床标本结果。
    （4）接种标本后的12孔细胞培养板进行离心培养，使用美国BECKMAN公司的J6-MC离心机，2000转／分钟，35℃离心60分钟。离心后的12孔细胞培养板置于35.5℃和5%CO2温箱吸附1小时，然后吸去接种物，加入病毒培养液（1%FBS DMEM培养基，含万古霉素50μg／ml，庆大霉素50μg/ml和二性霉素B 2.5μg／ml），病毒培养液加入量为每孔1.5～2ml，12孔细胞最终置于35.5℃和5% CO2温箱培养，每日观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。接种后3～4天更换病毒培养液1次。
    3.病毒培养鉴定
    （1）当病毒在培养细胞中生长时，可出现明显的CPE，表现为细胞肿胀变圆，折光性增强，有些呈葡萄串样改变，最终可见感染细胞死亡脱落。
    （2）一旦细胞出现明显的CPE应立即保存阳性培养物，并进行鉴定，使用直接荧光法（DFA）。保存阳性培养物：将CPE孔内的病毒培养液吸出后加入含1滴20% BSA溶液的2ml无菌管内并- 80℃冰箱保存。DFA鉴定：无菌0. 01mol/L PBS，pH7.4洗涤细胞面2次，加入3滴消化液，37℃消化10分钟，细胞生长液再悬浮消化后的细胞并吸回至试管内，塑料吸管反复吹打数次，PBS洗涤2次（1000转／分钟离心3分钟）。最终0. 5ml的PBS再悬浮，滴10孔玻片一张，保留剩余可疑感染细胞悬液以备用。滴片后的玻片在生物安全柜内吹干，冷丙酮固定的抗呼吸道病毒的单克隆抗体，滴加量约每孔10μl，均为美国 LIGHT DIAGNOSTICSTM Chemicon International公司产品，现为Millipore公司。
    1）流感病毒甲型。
    2）流感病毒乙型。
    3）副流感病毒1型。
    4）副流感病毒2型。
    5）副流感病毒3型。
    6）腺病毒。
    7）呼吸道合胞病毒。
    （3）37℃湿盒内温育30分钟，PBS洗片2次，DW漂洗1次。晾干后封片甘油封片。荧光显微镜下观察结果。
    （4）接种后10天仍然未出现CPE的接种孔，使用上述7种混合的荧光标记的呼吸道病毒单克隆抗体（LIGHT DIAGNOSTICSTM Respiratory Viral Screen DFA）进行染色抗原检测，以防止极少数情况下有病毒培养生长，但产生的CPE不明显。操作方法同于出现CPE病变的培养孔。
    【参考范围】
    正常人群呼吸道病毒培养应为阴性，驻留罕见。
    抗沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体IgG和IgM抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    沙眼衣原体L2/43 4/Bu株、肺炎衣原体CWL-029（ATCCVR1310）株和鹦鹉热衣原体6BC株接种BGMK细胞株（绿猴肾细胞），超声波破碎感染细胞，释放衣原体，阶层梯度密度离心纯化衣原体抗原（EBs）。将纯化的沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体抗原经1%甲醛固定后分别滴涂在特殊印制的28孔载玻片上，再次丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在-20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗沙眼衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体IgG和IgM抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1. Wang SP，Kuo CC，Grayston JT. Formalinized Chlamydia trachomatis organisms as antigen in the micro-immunofluorescence test.J Clin Microbiol，1979，10:259
    2. Grayston JT，Campbell LA，Kuo CC，et al.A new respiratory tract pathogen:Chlamydia pneumoniae strain TWAR.J Infect Dis，1990，161:618
    3.Moss TR，Darougar S，Woodland RM，et al.Antibodies to Chlamydia species in patients attending a genitourinary clinic and the impact of antibodies to C pneumoniae and C psittaci on the sensi- tivity and specificity of C trachomatis serology tests. Sex Transm Dis，1993，20:61
    4.倪安平，王辉，董平，等.肺炎支气管炎和急性上呼吸道感染患者肺炎衣原体感染的研究.中华内科杂志，1995，34:388
    5. Ni AP，Ling GY，Yang L，et al.A seroepidemiologic study of C.pneumoniae，C. trachomatis and C.psittaci in different populations in the mainland of China. Scand J Infect Dis，1996， 28:553-557
    6.李丽，倪安平，于维琴.鹦鹉热衣原体肺炎一例.中华结核和呼吸杂志，1999 ，22：662
    7.Mahony JB， Coombes BK，Chernesky MA. Chlamydia and Chlamydophila//Murray PR， Baron EJ，Jorgensen JH. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington DC: ASM Press，2003:991-1004
    抗弓形虫IgG抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    弓形虫RH株接种Vero细胞，增殖后经纯化、甲醛固定后滴涂在印制的28孔片上。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在-20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗弓形体IgG抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1.中华人民共和国卫生行业标准.刚地弓形虫血清学试验临床应用和解释（草案）——Clini- cal Use and Interpretation of Serologic Tests for Toxoplasma gondii； Approved Guideline， WS/T××X-200×
    2.Smith SB，Repetti CF. Evaluation of a rapid screening immunoassay for antibodies to Toxo- plasma gondii.J Clin Microbiol，1987，25:2207-2208
    3. Moyer NP， Hudson JD， Hausler WJ Jr.Evaluation of MUREX SUDS Toxo test.J Clin Microbi01，1987，25:2049-2053
    4.倪安平，郝英英，朱晓春，等.孕产妇四种病原体感染的血清学筛查的研究，中华检验医学杂志，2003，26:142-144
    抗风疹病毒IgG抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    风疹病毒Gos株感染Vero细胞，经消化洗涤后滴涂在印制的28孔片上，自然干燥后丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在-20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗风疹病毒IgG抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1. Hossain A，Ranua S，Bakir TM- Comparison of haemagglutination test， enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunofluorescence antibody test for determination of rubella immune status.J Trop Med Hyg，1988，91:216-221
    2.Kleeman KT， Kiefer DJ， Halbert SP. Rubella antibodies detected by several commercial
    immunoassays in hemagglutination inhibition-negative sera.J Clin Microbiol， 1983， 18: 1131-1137
    3.Zartarian MV，Friedly G，Peterson EM，et al.Detection of rubella antibodies by hemaggluti- nation inhibition， indirect fluorescent-antibody test， and enzyme-linked immunosorbent assay.J Clin Microbiol，1981，14: 640-645
    4.倪安平，郝英英，朱晓春，等.孕产妇四种病原体感染的血清学筛查的研究.中华检验医学杂志，2003，26:142-144
    抗单纯疱疹病毒（1+2型）IgG抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    单纯疱疹病毒SM44（HSV-1）和G株（HSV-2）分别接种HEp-2细胞，待完全出现细胞病变后，胰酶消化HSV-1和HSV-2感染细胞，并将HSV-1和HSV-2感染细胞等量混合，PBS洗涤后滴涂印制的28孔片，丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在- 20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗单纯疱疹病毒（1+2型）IgG抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1. Pacsa AS，Pejtsik B. Detection of antibodies to cytomegalovirus，herpes simplex virus and rubella virus with the micro-enzyme immunoassay. Acta Microbiol Acad Sci Hung，1979， 26:35-40
    2.Islah H.El Falaky，Bent Faber Vestergaard，Allan Hornsleth.IgG，IgA and IgM antibodies response in patients with acute genital and non-genital herpetic lesions determined by the indirect fluorescent antibody method. Scan J Infect Dis，1977，9:79-84
    3.倪安平，郝英英，朱晓春，等.孕产妇四种病原体感染的血清学筛查的研究.中华检验医学杂志，2003，26:142-144
    抗巨细胞病毒IgG抗体测定抗原片制备
    【操作步骤】
    CMVAD169株感染人胚肺成纤维细胞。胰酶消化并破碎感染细胞，纯化细胞核包涵体，同时加入1／3的正常HEp-2细胞核用于内参阴性对照，上述混合的细胞核悬液滴涂在印制的28孔片上，自然干燥后丙酮固定。制备的抗原片封入含干燥剂的锡纸口袋内，在-20℃保存至少1年，在-80℃可长期保存。
    【质控】
    每批抗原片在大规模制备前先试验性制备一张，检测阳性和阴性质控血清标本中的抗巨细胞病毒IgG抗体，如果结果与上一批抗原片抗体差别在±1个滴度以内，则视为合格，可以进行大规模抗原片滴涂制备，并将大规模制备后的抗原片再次进行上述质控，合格后方可使用。
    【参考文献】
    1.Stagno S，Reynolds DW，Smith RJ. Use of isolated nuclei in the indirect fluorescent-antibody test for human cytomegalovirus infection:comparison with microneutralization，anticomple— ment，and conventional indirect fluorescent-antibody assays.J Clin Microbiol， 1978，7: 486-489
    2.倪安平，郝英英，朱晓春，等.孕产妇四种病原体感染的血清学筛查的研究.中华检验医学杂志，2003，26:142-144
    【临床意义】
    HBsAg是患者感染HBV后首先出现的标记物。可用于诊断乙肝病毒的感染，并监测乙型肝炎疾病的进展阶段。在判断急性或慢性乙肝时，应结合HBsAg阳性患者的病史和其他乙肝血清学标志结果综合进行诊断。
    【标本要求】
    1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
    2.采样量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent Microparticle Immuno Assay，CMIA）。定量检测人血清或血浆中的HBsAg。
    2.原理 利用单克隆Anti-HBsAg包被微粒子检测HBsAg的CMIA技术，通过两步法进行免疫测定。将样本和Anti-HBs包被顺磁微粒子合并。样本中存在的HBsAg便结合到Anti-HBs包被顺磁微粒子。洗涤后，加入吖啶酯标记Anti-HBs的结合物。再次洗涤之后，加入预激发液和激发液到反应混合物中。测定得到的化学发光反应，以相对发光值（RLU）表示。样本中的HBsAg数量与ARCHITECT i*系统光学检测的RLU之间成正比。
    样本中HBsAg的浓度是通过ARCHTITECT HBsAg标准曲线确定。如果样本浓度≥0. 051U/ml，该样本即可视为HBsAg阳性。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT i2000全自动免疫化学发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT HBsAg试剂盒
    （1）微粒子（1瓶）：在MES缓冲液中配制的Anti-HBs（鼠，单克隆，IgM，IgG）包被微粒子。
    （2）结合物（1瓶）：在MES缓冲液中制备的吖啶酯标记Anti-HBs（山羊，IgG）结合物。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32%（w/v）过氧化氢的预激发液。
    （2）激发液：含0.35mol／L氢氧化钠的激发液。
    （3）洗涤液：含磷酸盐缓冲液。
    （4）配套质控品：包含阳性质控品1、阳性质控品2和阴性质控品。
    （5）配套校准品：校准品1和校准品2。
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行校准时，以复管检测标准品1和2。校准范围：0～2501U／mL。ARCHITECT HBsAg的所有质控水平必须取一个样本进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。
    一旦ARCHITECT HBsAg校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目HBsAg，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
    质控要求每24小时取各个质控水平进行检测。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目HBsAg，选择F3-Add order，完成申请，在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。
    4.试剂装载检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 %CV≤11.9。
    2.灵敏度99. 52%。
    3.特异性99. 87%。
    【参考范围】
    ARCHITECT HBsAg结果判断：
    （1）样本浓度值＜0. 05IU/ml为阴性。
    （2）样本浓度值≥0.05IU／ml为阳性。
    （3）当HBsAg浓度值超过250IU／ml时，标记为＞250. 00IU／ml。
    【参考文献】
    1.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版.北京：人民卫生出版社，2007
    2.贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.临床肝胆病杂志，2011，1
    3.庄辉.乙型肝炎流行病学研究进展.国外医学：流行病学·传染病学分册，2004，3
    4.李金明，乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题.中华检验医学杂志，2006， 29（15）
    5.李金明，王露楠，徐锡霞，等.室内质量控制对乙型肝炎表面抗原测定准确度的影响.中华检验医学杂志，2001:24（4）：255
    6. Carmen WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. Journal of Viral hepatitis，1997，4 （Suppl.1）:11-20
    7. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Dis- eases Transmitted by Blood，Body Fluids and Tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu- ment M29-A（ISBN l-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
    8. NCCLS. Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods； Ap-proved Guideline - Second Edition NCCLS Document EP5-A2 ［ISBN 1-56238-542-9］. NC-CLS，940 West Valley Road，Suite 1400，Wayne，PA 19087-1898 USA，2004
    【临床意义】
    Anti-HBs常用于定量监测乙肝疫苗接种后的免疫应答，阳性个体可防止乙肝病毒（HBV）感染，对机体有保护作用。也可用于判断乙肝感染个体的血清转换和HBV急性感染的恢复。在无症状个体中检测到Anti-HBs也可提示既往HBV感染。
    【标本要求】
    1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
    2.采样量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法化学发光微粒子免疫测定法（CMIA）。定量检测人血清和血浆中的乙肝表面抗体（Anti-HBs）。
    2.原理样本和重组HBsAg（rHBsAg）包被顺磁微粒子合并。样本中存在的Anti-HBs便结合到rHBsAg包被微粒子上。洗涤后，加入吖啶酯标记rH-BsAg结合物。再次循环洗涤之后，加入预激发液和激发液到反应混合物中。测定由此得到的化学发光反应，以相对发光值（RLU）表示。样本中的Anti-HBs数量与系统光学检测的RLU之间成正比。利用前面产生的校准曲线测定样本中Anti-HBs的浓度。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT i2000全自动免疫发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT Anti-HBs试剂盒包括： （ 1）微粒子：用Tris缓冲液中配制的乙肝表面（E. coli，重组）抗原（亚型ad和ay）包被微粒子。
    （2）结合物：用MES缓冲液中配制的吖啶酯标记乙肝表面（E. coli，重组体）抗原（亚型ad和ay）结合物。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32%（W/V）过氧化氢的预激发液。
    （2）激发液：含0.35mol／L氢氧化钠的激发液。
    （3）洗涤液：含磷酸盐缓冲液。
    （4）配套质控品：包含阳性质控品1、阳性质控品2和阴性质控品。
    （5）配套校准品：校准品1和2
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibrationorder，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行校准时，以复管检测标准品1和2。校准范围：0～1000mIU/ml。ARCHITECT Anti-HBs的所有质控水平必须检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。一旦ARCHITECT Anti-HBs校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目Anti-HBs，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
    建议每24小时取各个质控水平进行检测。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下，可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目Anti-HBs，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
    4.试剂装载 检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 %CV≤13.4。
    2.灵敏度    97. 54%。
    3.特异性    99. 67%。
    【参考范围】
    ARCHTIECT Anti-HBs结果判读：
    （1）≥10. 0mIU／ml为阳性。
    （2）＜10. 00mIU/ml为阴性。
    （3）样本中Anti-HBs超过1000mIU/ml时，以＞1000. 00mIU/ml表示。
    【参考文献】
    1.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版.北京：人民卫生出版社，2007
    2.贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.临床肝胆病杂志，2011，1
    3.庄辉.乙型肝炎流行病学研究进展.国外医学：流行病学·传染病学分册，2004，3
    4.李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题.中华检验医学杂志，2006，29（15）
    5.黄利华.HBV血清标志物特殊模式的再认识.国外医学：流行病学·传染病学分册， 2002，2
    6.洪俊，饶永彩.全自动发光免疫分析仪在HBV血清标志物检查中的应用，职业与健康，2010，3
    7. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis- eases Transmitted by Blood，Body Fluids and tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu- ment M29-A（ISBN l-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
    【临床意义】
    HBeAg检测可用于监测HBV感染的进展状况和个体对药物治疗的反应。HBeAg阳性提示感染者具有高传染性。HBeAg的出现与血清中感染病毒（Dane颗粒）数量的增加、肝细胞核中核心颗粒和血清中HBV特定DNA及DNA聚合酶的出现有关。慢性HBV感染中，HBeAg可能与HBsAg -起持续存在。
    【标本要求】
    1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）；
    2.量 静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存 分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemilumlnescent Microparticle Immuno Assay，CMIA）。定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）。
    2.原理 ARCHITECT HBeAg检测项目是一种两步法免疫检测。第一步，混合样本、测试稀释液和抗-HBe（鼠，单克隆）包被顺磁微粒子。样本中的HBeAg结合至抗-HBe包被微粒子上。冲洗后进入第二步，加入吖啶酯标记的抗-HBe结合物。再次冲洗后，向反应混合物中加入预激发液和激发液。通过相对发光单位（RLUs）对产生的化学发光反应进行测量。样本中的HBeAg数量与ARCHITECT光学系统检测到的RLU有直接关系。对于样本中是否含有HBeAg，需要把反应产生的化学发光信号和以往ARCHITECT HBeAg校准生成的临界信号值进行比较。化学发光信号如低于样本信号临界值（S/CO），该样本可测定为HBeAg呈阴性。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT i2000全自动免疫发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT HBeAg测定试剂盒，包括：
    （1）微粒子：在磷酸盐缓冲液中配制的抗-HBe（鼠，单克隆）包被微粒子。
    （2）结合物：在MES缓冲液中配制的吖啶酯标记抗-HBe（鼠，单克隆）结合物。
    （3）稀释液：含复钙人血浆的磷酸盐缓冲液。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32% （W／V）过氧化氢。
    （2）激发液：含0.35mol／L的氢氧化钠。
    （3）清洗缓冲液：含磷酸盐的浓缩缓冲液。
    3.ARCHITECT Anti-HBs配套质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。
    4.ARCHITECT Anti-HBs配套校准品：校准品1。
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目HBeAg，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行校准时，需要对校准品1和2重复检测三次。所有HBeAg质控水平必须进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。一旦ARCHITECT HBeAg校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目HBeAg，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
   建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
    4.试剂装载检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 % CV≤10%（当S/CO≥1.000）；%CV≤22. 9%（当S/CO＜1. 000）。
    2.灵敏度≥99.5%。
    3.特异性≥99. 0%。
    【参考范围】
    ARCHITECT HBeAg测定结果解释：
    1.检测值S/CO＜1.0为阴性。
    2.检测值S/CO≥1.0为阳性。
    【参考文献】
    1.庄辉.我国乙型肝炎病毒感染与挑战.中华传染病杂志，2005，S1
    2.马慧，郭芳，魏来，等.HBeAg阴性和HBeAg阳性乙型肝炎肝硬化患者临床特征及预后的前瞻性研究.中华医学杂志，2007，26
    3.唐跃华，谢健敏.慢性乙型肝炎患者血清HBeAg、HBV-DNA与肝组织炎症关系的探讨，中华传染病杂志，2005，23（5）
    4.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版.北京：人民卫生出版社，2007
    5.李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题，中华检验医学杂志.2006， 129（15）
    6. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis-eases Transmitted by Blood，Body Fluids and tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu-ment M29-A（ISBN 1-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
    【临床意义】
    乙型肝炎e抗体（抗-HBe）的出现与乙型肝炎病毒（HBV）感染有关，阳性时提示病毒复制减弱，病毒数量减少，处于感染恢复期。急性乙肝感染期间HBeAg与抗-HBe的血清转换通常是提示HBV感染减轻和感染水平下降。慢性乙型肝炎的患者当血清没有检出HBeAg，但抗-HBe呈阳性，提示可能仍有乙肝病毒DNA复制。此外，在治疗慢性乙肝患者时，HBeAg/抗-HBe的血清转换可作为病毒应答的一个指标。
    【标本要求】
    1.种类 血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
    2.量 静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存 分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent MicroparticleImmuno Assay，CMIA）。定性检测人血清和血浆中的抗-HBe。
    2.原理 ARCHITECT抗-HBe检测为两步免疫竞争测定。将样本、中和试剂和抗-HBe（鼠，单克隆）包被顺磁微粒子混合，样本中存在的抗-HBe与中和试剂中存在的重组HBeAg（rHBeAg）结合。未结合的rHBeAg与抗-HBe包被微粒子结合。洗涤后，在第二步加入吖啶酯标记的抗-HBe结合物。再次洗涤后，加入预激发液和激发液到反应混合物中。测定化学发光反应结果，以相对发光值（RLU）表示。样本中的抗-HBe含量与ARCHITECT i*系统光学检测的RLU之间成反比。通过比较反应中的化学发光信号和ARCHITECT抗-HBe校准检测的临界信号，判断检测样本中是否存在抗-HBe。如果反应中的化学发光信号大于ARCHITECT抗-HBe校准检测的临界信号，那么该样本为抗-HBe阴性。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT 12000全自动免疫发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT抗-HBe试剂盒，包括：
    （1）微粒子：TRIS缓冲液配制的抗-HBe（鼠，单克隆）包被微粒子。
    （2）结合物：MES缓冲液配制的吖啶酯标记抗-HBeAg（鼠，单克隆）结合物。
    （3）中和试剂：TRIS缓冲液配制的重组HBeAg。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32%（W／V）过氧化氢的预激发液。
    （2）激发液：含0.35mol／L氢氧化钠的激发液。
    （3）洗涤液：磷酸盐浓缩缓冲液。
    3.ARCHITECT抗-HBe配套质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。
    4.ARCHITECT抗-HBe配套校准品：校准品1。
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Calibration order，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行抗-HBe校准时，需要对校准品1重复检测三次。所有质控水平必须取一个样本进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。
    一旦ARCHITECT抗-HBe校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目抗-HBe，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
    建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定 在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目抗-HBe，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
    4.试剂装载 检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 %CV≤10. 0%；
    2.灵敏度≥97. 54%。
    3.特异性≥99. 67%。
    【参考范围】
    结果解释：
    1.样本S/CO值＞1. 00为抗-HBe阴性。
    2.样本S/CO值≤1.00为抗-HBe阳性。
    【参考文献】
    1.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版.北京：人民卫生出版社，2007
    2.贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.临床肝胆病杂志，2011，1
    3.谢士达，刘成永，高玉金，等.HBeAg和抗-HBe血清学转换的动态变化对拉米夫定疗效的评价，肝脏，2005，（04）
    4.张国庆，白娜，田巧.HBV DNA定量与乙肝病毒标志物及肝功能的相关性分析，中外医疗，2011，（03）
    5.李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题，中华检验医学杂志，2006， 29（15）
    6. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis-eases Transmitted by Blood，Body Fluids and Tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu-ment M29-A（ISBN l-56238-339-6）. NCC LS，Wayne，PA 19087； 1997
    【临床意义】
    Anti-HBc可用于监测HBV感染，提示被检者可能是活动性感染或提示处于感染恢复期。在其他HBV指标都缺乏的情况下，被检者应视为已被HBV感染。在没有其他感染指标的情况下，Anti-HBc可能是HBV感染和血液潜在感染的唯一的血清学标志。
    【标本要求】
    1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠、或EDTA抗凝）。
    2.量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存分离后的血清或血浆在2～8℃保存7天，如果在7天内不能完成检测，标本应保存在-20℃。
    【方法与原理】
    1.方法 化学发光微粒子免疫分析（Chemiluminescent Microparticle Im-muno Assay，CMIA）。定性检测人血清和血浆中的乙肝核心抗体（Anti-HBc）。
    2.原理 ARCHITECT Anti-HBc检测是一种两步法免疫测定。首先将样本、检验稀释液和HBc抗原包被顺磁微粒子合并。样本中存在的Anti-HBc便结合到HBc抗原包被微粒子上。洗涤后，在第二步加入吖啶酯标记抗-人结合物。再次洗涤后，加入预激发液和激发液到反应混合物中。测定化学发光反应结果，以相对发光值（RLU）表示。样本中的Anti-HBc数量与ARCHITECT i*系统光学检测的RLU之间成正比。通过比较反应中的化学发光信号和ARCHI-TECT Anti-HBc校准确定的临界信号，判断检测样本中是否存在Anti-HBc。如果反应中的化学发光信号大于或等于临界信号，该样本即可视为Anti-HBc阳性。
    【仪器】
    美国雅培公司ARCHITECT 12000全自动免疫发光分析仪。
    【试剂】
    1.美国雅培公司ARCHITECT Anti-HBc试剂盒
    （1）微粒子（1瓶）：用MOPSO缓冲液配制的HBc（E.coli，重组）抗原包被微粒子。
    （2）结合物（1瓶）：MES缓冲液配制的吖啶酯标记抗-人（鼠，单克隆）结合物。
    （3）检验稀释液：用MOPSO缓冲液配制的Anti-HBc检验稀释液。
    2.其他试剂
    （1）预激发液：含1.32%cw/v）过氧化氢的预激发液。
    （2）激发液：含0.35mol/L氢氧化钠的激发液。
    （3）洗涤液：含磷酸盐缓冲液。
    3.ARCHITECT Anti-HBc配套质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。
    4.ARCHITECT Anti-HBc配套校准品：校准品1。
    试剂盒在系统上贮存最多为30天。30天后，试剂盒必须丢弃。
    【操作步骤】
    1.校准 在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Caliorationorder，选择要校准的项目，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认校准。
    执行Anti-HBc校准时，需要对校准品1重复检测三次。Anti-HBc所有质控水平必须取一个样本进行检测，以用于校准评估。确保质控值在质控包装说明书所规定的浓度范围内。校准品必须首先装载。
    一旦ARCHITECT Anti-HBc校准通过并贮存，后面的样本都可以检测而无需进一步校准，除非：
    （1）使用新批号的试剂盒。
    （2）质控值在范围之外。
    2.质控在Running屏幕下，选择Order下拉式菜单中的Control order，选择要分析的项目Anti-HBc，样品架号及起始位置，选择F2-Add order确认。
    建议每24小时检测一次质控品。确保检测的质控值在质控品包装说明书上所规定的范围内。在下列情况下可以多次使用质控品以验证检测结果，并相应地遵循实验程序。
    （1）更换试剂批号。
    （2）重新定标后。
    （3）质控值在规定范围之外。
    （4）仪器移动或故障维修后。
    3.样本测定 在Running屏幕下，在Order菜单中选择Patient order，选择样本架和起始位置，输入要测试的项目Anti-HBc，选择F3-Add order，完成申请（如系统已采用双向信息传输，此步操作可以省略）。在LIS系统下录入患者的信息及患者标本编号。
    4.试剂装载 检查试剂的效期，试剂瓶内是否有气泡，根据试剂盘上的颜色提示放置试剂瓶。检查上机试剂、耗材库存和废物量情况。
    【性能参数】
    1.精密度 %CV≤22.1%。
    2.灵敏度≥98. 63%。
    3.特异性≥99. 42%。
    【参考范围】
    结果解释：
    1.样本S/CO值＜1. 00为阴性。
    2.样本S/CO值≥1.00为阳性。
    【参考文献】
    1.骆抗先.乙型肝炎基础和临床.第3版，北京：人民卫生出版社，2007
    2.贾继东，李兰娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.临床肝胆病杂志，2011，1
    3.庄辉.乙型肝炎流行病学研究进展.国外医学：流行病学·传染病学分册，2004，3
    4.李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题.中华检验医学杂志，2006， 29（15）
    5.李金明.感染性疾病免疫测定的室内质量控制.医学检验与临床，2007，18（1）
    6. NCCLS. Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Dis-eases Transmitted by Blood，Body Fluids and Tissue； Approved Guideline. NCCLS Docu-ment M29-A（ISBN 1-56238-339-6）. NCCLS，Wayne，PA 19087； 1997
    【临床意义】
    甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）属于微小RNA病毒，具有嗜肝性，其宿主范围狭窄，只感染人和几种高等灵长类动物。HAV为无囊膜病毒颗粒，内含RNA基因，外层为衣壳蛋白包裹。抗HAV IgM为HAV衣壳蛋白抗体。抗HAV IgM阳性，表明机体正在感染HAV，是早期诊断甲型肝炎的特异型指标。抗HAV IgM阳性率在发病2周为100%，1个月76.5%，3个月为23. 5%，6个月为5. 9%，12个月时为阴性。但有些感染者抗HAV IgM维持时间很短（约1周），且仅为临界值。也有一些患者抗HAV IgM应答“缺失”，即血中未能测出抗HAV IgM，此类患者可借助于抗HAV IgM呈上升表现或参考HAVAg来确诊甲型肝炎。
    在慢性乙型肝炎或自身免疫性肝病患者血清中检测抗HAV IgM阳性时，判断HAV重叠感染应慎重，须排除类风湿因子（RF）及其他原因引起的假阳性。接种甲型肝炎疫苗后2～3周约8%～20%接种者可产生抗HAV IgM，应注意鉴别。
    【标本要求】
    1.种类血清或血浆（肝素、枸橼酸钠或EDTA抗凝）。
    2.标本量静脉血2ml，常规分离血清或血浆。
    3.保存血清或血浆标本分离后7天之内可放置于2～8℃保存，超过7天在-20℃保存。
    【仪器】
    酶标仪，洗板机和振荡器。
    【方法与原理】
    1.方法 酶联免疫法。
    2.原理 抗人IgM抗体（μ链）包被酶免疫微孔板，加入待检血清标本后，与血清中全部IgM抗体结合（捕获），如果被捕获的抗体存在特异性的抗HAVIgM抗体，则与随后加入的HAV抗原结合，同时加入辣根过氧化物酶标记的抗HAV抗体再与HAV抗原结合，辣根过氧化物酶催化加入的底物溶液显色。颜色深浅与血清中甲型肝炎IgM抗体的量成正比。
    【试剂】
    上海实业科华生物技术有限公司产品。
    1.抗人IgM抗体（μ链）包被的酶免疫微孔板。
    2.HA抗原溶液。
    3.酶结合物，即辣根过氧化物酶标记的抗HAV抗体。
    4.抗-HAV IgM阳性和阴性对照。
    5.浓缩洗涤液（0. 4mol／L Tris），用时需1: 20稀释。
    6.底物液TMB。
    7.终止液（2nlol/LH2SO4）。
    【操作步骤】
    1.按照所需数量在板架上放好酶标板条，按顺序编号。
    2.待测标本血清或血浆用生理盐水1：1000稀释，每孔加入稀释后的标本100μl及阴、阳性对照100μl于相应孔中，设空白对照孔（加100μl洗涤液），封板，置37℃温育20分钟。
    3.洗涤 用洗涤液洗5次。
    4.除空白对照孔外，每孔加入HAV抗原30μl、酶结合物各50μl，振荡均匀，置37℃20分钟。
    5.同步骤3洗涤。
    6.每孔加底物液A液和B液各每孔50μl，振荡混匀，置37℃温育10分钟。
    7.每孔中加50μl终止液。
    8.在450nm波长测定OD值，用空白孔校零，读取OD值。
    9.结果判定：临界值（COV）=阴性对照平均OD值×2.1
    （当阴性对照孔OD值小于0.05时，按0.05计算）。
    （1）标本OD值＜COV，为阴性。
    （2）标本OD值≥COV，为阳性。
    【参考范围】
    阴性。
    【参考文献】
    1.刘锡光，祁自柏.病毒性肝炎实验诊断学.北京：人民卫生出版社，1999:357
    2.李金明.临床酶免疫测定技术.北京：人民军医出版社，2005:87
    3.病毒性肝炎防治方案.传染病信息，2000，（04）：
    4. Duermeywe W.A new principle for the detection of specific IgM antibodies applied in an ELISA for hepatitis A.J Med Vir01，1979，4（1）:25
    5.Duermeywe W. Specific detection of IgM-antibodies by ELISA，applied in hepatitis A.Lan-cet，1978，2（8091）：684
   


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